基因敲除方法的比较.docVIP

方法 原理 优点 不足 应用 利用同源重组进行基因敲除 利用DNA转化技术,将含有目的基因和靶基因同源片段的重组载体导入靶细胞,通过载体与靶细胞染色体上同源序列间的重组,将外源基因整合入内源基因组内,使外源基因得以表达。通过研究靶细胞或者个体在目的基因插入前后遗传特性的改变,达到研究基因功能的目的。 具有高度特异性和方向性，外源片段也具有可操作性 1)操作复杂,实验周期长,费用偏高;(2)在敲除过程中,被破坏的常常只是靶基因的部分外显子而并不是整个编码区,残留的编码序列有可能组合出新的未知的功能,这将给表型分析带来麻烦;(3)对于某些必需基因,敲除后会造成细胞死亡,也就无法研究这些必需基因的功能;(4)由于基因功能上的冗余,敲掉一个基因并不能造成容易识别的表型;(5)同一个打靶载体在不同遗传背景下进行基因敲除,获得的表型差异很大。 噬菌体的Cre/Loxp系统和酿酒质粒的FLP/FRT系统 利用随机插入突变进行基因敲除 利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 效率高、基因完全失活、容易分离鉴定被插入引起失活的目的基因等 1以农杆菌介导的T-DNA插入突变只适用于那些容易被T-DNA转化的植物,且常常会引起的染色体重排现象,使突变体表型与T-DNA插入无关而难以进行遗传学分析。 2转座子插入突变要求转座子本身较短,容易操作,且对任何拟敲除区域有较高转座效率等 以农杆菌介导的T-DNA插入突变 转座子插入突变 RNA干扰引起的基因敲除 是由与生物体内 源靶基因 mRNA 同 源 的 双 链RNA 特异性引发的靶 ｍ ＲＮＡ降解，导致目的基因表达沉默的一种反向遗传学技术。 1)特异性强,针对同源基因共有序列的RNAi则只能导致同源基因失活,不影响其他内源性mRNA的表达;(2)效率高;(3)穿透性强 1缺乏有效的siRNA载体 2无法彻底去除目的基因 3在哺乳动物中的应用还处于探索阶段，实验方法不够成熟。 1对于一些敲除后小鼠在胚胎时就会死亡的基因，可以在体外培养的细胞中利用RNAi技术研究它的功能。 2由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通路的良好工具。 3RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过程中其起着关键作用。