生物公司内部-荧光定量PCR的全面SOP.docVIP

PAGE 7 实时荧光定量PCR (Q-PCR) SOP流程 实验前需要确认的信息 客户提供样本的数量、编号、种属、样本来源部位。 样本类型（细胞或组织等）。 保存条件。 检测方法。 检测指标。 上样顺序。 试剂是否齐全。 客户基本信息：姓名、邮件地址、电话信息等。 实验开始前需要准备的试剂及仪器 [实验试剂] 试剂名称 试剂用途 生产商 货号 RNA抽提试剂 TRIZOL 裂解细胞，释放RNA invitrogen 15596-026 氯仿 使有机相和无机相迅速分离，萃取RNA 江苏永华 151902104 异丙醇 沉淀RNA 国药75%乙醇 (用DEPC水和无水乙醇配) 清洗RNA，去除杂质 国药红细胞裂解液 去除红细胞 BD MG0048 DEPC水 溶解RNA沉淀 生工 DD1005 逆转录相关试剂 dNTP Mixture(10mM) DNA聚合酶的底物 Takara D4030RA RTase M-MLV(RNase H-) RNA反转录酶 Takara D2639A RNasin Inhibitor（40units/μl） RNA抑制剂 Takara D2313A Random Primer 随机引物 Takara D3801 Q-PCR反应相关试剂 SYBR Premix Ex Taq（2×） 荧光染料 Takara DRR420A Deoxyribonuclease I (DNase I) DNA酶 Takara D2210 [实验仪器] 名称 生产商 型号 国别 PCR扩增仪器 Bio-rad PTC-100 美国 匀浆机 IKA T8 德国 微量核酸蛋白检测仪 ABI 7500 美国 实时荧光定量PCR仪 NanoDrop ND-1000 美国 Q-PCR实验操作流 实验原理（简单描述） 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，可通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 实验总体注意事项 为得到最佳的实验结果，实验人员要尽可能减少样品间交叉污染的可能，避免将核酸从一个实验带入下一个实验。以下措施有助于避免实验污染问题： 用稀释的漂白剂或净化剂以及75%酒精抹擦工作台。 理想的条件是在指定地配有紫外灯的超净室、罩式或台式超净台中准备样品，如果没有要确保操作台的洁净。 在样品准备和配制反应液过程中勤换手套。 使用专门的移液器和枪头，勤用稀释的漂白剂清洁移液器。 只使用PCR级的水和PCR专用试剂进行PCR实验。 用带旋盖的EP管稀释和配制反应液。 除了注意以上事项，在进行PCR实验时，还应准备一个无模板的对照来验证有无污染发生。 为最小化实验结果的统计学偏差，先制备混合反应液，建议所有样本有三个重复。大剂量包装的反应试剂，使用前进行分装，尽量减少试剂的反复冻融。 标准步骤: 基本流程：RNA的提取→反转录成cDNA→引物设计→Q-PCR的扩增 不同样本RNA抽提： 组织样本，先用液氮研磨破碎或者加TRIZOL溶液后用匀浆机破碎。一般需要客户提供动植物组织30-50mg（如黄豆大小），如果组织完整需要先将其剪碎至小块状以便于匀浆，加1mlTRIZOL，根据提供的样本量以此增加或减少加入的TRIZOL量。租用平台的匀浆机，在冰上操作，用PBS清洗匀浆机机头，用纸擦干，伸入1.5mlEP管至TRIZOL溶液2/3处每次匀浆3-5秒，防止机头过热，直到明显组织块均破碎，每换一个样本匀浆都要清洗机头。 全血样本，先以1:3-1:5（1ml样本加入3-5ml裂解液）加红细胞裂解液至样本中，室温静置10min，3500转6min，弃上清后加TRIZOL溶液。一般全血样本2-3ml对应1mlTRIZOL。 细胞样本，细胞一般接种孔板时用细胞计数板计数，1*105-1*106，细胞长到70-80%以上。 贴壁细胞吸掉旧的培养基，用PBS清洗两遍，加入1-2mlTRIZOL铺满孔板或培养瓶瓶底，几分钟后贴壁细胞脱落裂解完全加到EP管中。悬浮细胞吸到离心管中1200转离心2-3min，吸去废培养基加入1-2mlTRIZOL。 操作流程 以加1ml TRIZOL溶液为例，充分混匀，静置10min。 4℃12000g离心10min，吸取上清放入新的EP管中，不要吸到沉淀。 加入200ul氯仿剧烈振荡15S，然后室温静置5min。 4℃12000g离心15min，离心液体分三层（下面是氯仿，中间是油脂，上面是含RNA的溶液），小心吸取上层液