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通过扩增青霉素生物合成基因簇 提高产黄青霉在固态和液态发酵中的 青霉素产量 World J Microbiol Biotechnol (2008) 第二组 青霉素 次 级 代 谢 杀菌 影响青霉素产量高低 随机突变 基因工程 优化 基因过表达 结构基因 ( pcbAB , pcbC 和 penDE ) 构巢曲霉（ Aspergillus nidulans ） 产黄青霉（ Penicillium chrysogenum ） 整个的 基因簇 pcbAB – pcbC – penDE 上述研究均是利用产黄青霉 Wis54-1255 完成的， Wis54-1255 仅含有一个青霉素基因簇的拷贝并且只能 产生少量的抗菌素，而且实验结果只适用于 液态发酵 。 本实验中，研究者对比了在转入整个青霉素基因簇后 低产菌株（ Wis54-1255 ） 和 高产菌株（ P2-32 ） 青霉 素产量的差别，并且首次应用此法检测转化菌株在新 兴的 固态发酵（ SSF ） 技术（ Suryanarayan 2003; Barrios-Gonza ′lezand Mej?′ a 2007 ）中的反应。 材料和方法 ? 产黄青霉 Wis54-1255 —— 青霉素低产菌株 ? 产黄青霉 Wis54-1255 npe10 —— 其青霉素基因簇不完整 ? 产黄青霉 P2-32 —— 青霉素高产菌株 ? 可容纳青霉素基因簇以串联重复的方式扩增数倍 ? 产黄青霉 NRRL 1951 （野生型） —— 用作基因文库的 DNA 源 ? 枯草芽孢杆菌 ATCC 6633 —— 用于在生物测定中评估青霉 素 G 的产量 ? 大肠杆菌 DH5 a —— 用于粘性质粒基因文库和一般基因操 作的受体 菌株 材料和方法 质粒载体 cos 区 多克隆位点 腐草霉素抗性基因位点 （基因 ble ） —— 作为 真菌选择标记 删除 Pst I 和 Xba I 的限制 性酶切位点 IztapaCos 基因组文库的构建 野生型 NRRL 1951 IztapaCos 载体 全部 DNA 提取 Sau3A1 部分消化 去磷酸化 材料和方法 Bam HI- Xba I 消化 连接 材料和方法 基因组文库的筛选 pbcAB 探针 penDE 探针 【通过 PCR 方法获得】 以 TGACAGACTATGTGGGTCTAGACCT 和 CGCTGTAAAGGTAACGCTCTTAAGG 为引物， 并包括基因 pcbAB 编码区的 3 末端序列和 3 -UTR 的起始序列 【由 Hin dIII 酶切质粒 pULJL33 而获得】 大小为 0.3kb ，包含基因 penDE 的 3 末 端序列 通过切口转移标记上 α -32P-dCTP 于暗盒中在 -70oC 条件 下用 Hiperfilm- MP 胶片曝 光 1 小时 30000cfu/dish 副本 材料和方法 真菌的转化 E.coli 30 –80μg/ml 的梯度培养基 30 –80μg/ml 的梯度培养基 转化菌株 转化菌株 30μg/ml 腐草霉素 30μg/ml 腐草霉素 30μg/ml 腐草霉素 Wis 54-1255 npe 10 Wis 54-1255 P2-32 碱裂解 40kbp 粘性质粒 化 转 筛 选 对照 材料和方法 青霉素在琼脂上的产量 Somerson 培养基制成的琼 脂块 （ g/l, 乳糖 110 ， 葡萄糖 14 ， CaCO 3 20 ， KH 2 PO 4 6 ， MgSO 4 ?7H 2 O 6 ， 谷物浸提液 70 ， 苯乙酸 1.4 ） 接种了枯草芽孢杆 菌的胰蛋白胨 （ 1% 琼脂）培养 基中 转化菌株 的菌丝体 材料和方法 液态发酵 含有 50ml 复合 生长培养基 25 o C, 50rpm 培养 36 小时 取各菌株的孢子 接种 （ 1 × 106 ） 每隔一定时间，取 5 毫升培养物 含有 45ml 复合 生产培养基 25 o C, 250rp m 培 养 144 小时 转接 作为副本 材料和方法 固态发酵 经过 0.3-0.6mm 孔径筛过的甘蔗渣 改良的 Somerson 复合生产培养基 接种（ 2 × 106 孢子 /ml ） 初始的水分含量设定为 70% 在每个 Raimbault 型圆柱发酵罐中加入 12g 固体培养基 25 o C 条件下进行 144 小时，通气量设定为 2.4L/h 取出并混匀圆形容器中的内容物 取 1 克潮湿的培养 基样品测定其 pH 值和青霉素含量 1700rpm 离心 20 分钟，青霉素被抽提到 0.1M 的磷酸缓冲液中 从而使样品的 pH 值为 5.5 （如果有必要可加入 H 3 PO 4 调节 pH 值）。取 60 微升提取物或其稀释