13核酸提取质量保证与全自动核酸提取仪的性能评价-廖璞.doc

核酸提取质量保证 与自动核酸提取仪性能评价 廖 璞 重庆市临床检验中心 2015 . 10 重庆 内 容 引言 核酸提取质量评价与保证 自动核酸提取仪性能评价 结语 重庆市临床检验中心 引言 分子诊断 核酸提取 病原微生物 核酸检测 与纯化是 基础 器官移植 配型HLA 分型检测 分子诊断 染 和遗传性 疾病基因 检测 临床应用 用药个体化 肿瘤基因 核酸检测 检测 重庆市临床检验中心 核 酸 引言 核酸的紫外吸收 脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid, DNA) 核糖核酸 (ribonucleic acid, RNA) ? 线性高分子化合物，粘度极大； ? 多元酸，较强酸性； DNA纯品A260/A280=1.8 RNA纯品A260/A280=2.0 ? 核酸分子具有强烈的紫外吸收。 重庆市临床检验中心 引言 临床核酸提取标本类型 血液：全血、血清、血浆、血斑… 粪便、尿液、脑脊液… 多样化 分泌物：痰、乳汁、拭子… 细胞：肿瘤细胞、羊水细胞… 病理组织、微生物菌落… 重庆市临床检验中心 引言 核酸提取方法 病毒核酸 基因组核酸 RNA 提取方法 提取方法 提取方法 酶消化法 有机提取法 有机溶剂提取法 有机提取法 靶向捕获技术 盐析法 氯化铯密度梯度离心法 强变性剂提取法 酒精及氯化锂沉淀法 氯化铯及蔗糖密度梯度 硅材质技术 离心法 硅材质技术 … 离子交换法 离子交换层析法 硅材质技术 滤纸分离法 Oligo(dT) 亲和层析法 … 分离mRNA … CLSI- MM13A Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods 重庆市临床检验中心 引言 核酸提取基本步骤 裂解 分离 样本 纯化 释放 预处理 重庆市临床检验中心 引言 核酸提取与检测结果 核酸提取、扩增过程中人基因组的污染，导致测序结果被污染 重庆市临床检验中心 J Natl Cancer Inst. 2011 Jun 8;103(11):847-8. 引言 核酸提取与检测结果 我室核酸纯化过程中乙醇未完全去 除导致测序结果出现杂峰 乙醇未完全去除标本 乙醇完全去除标本 重庆市临床检验中心 引言 核酸提取与检测结果 重庆市临床检验中心 Anal Biochem. 2015 Jun 15;479:60-2. 引言 核酸提取与检测结果 重庆市临床检验中心 Clin Chim Acta. 2015 Feb 2;440:205-10. 引言 核酸提取与检测结果 重庆市临床检验中心 Clin Chim Acta. 2015 Feb 2;440:205-10. 引言 核酸提取与检测结果 重庆市临床检验中心 Clin Chim Acta. 2015 Feb 2;440:205-10. 内 容 引言 核酸提取质量评价与保证 自动化核酸提取仪性能评价 结语 重庆市临床检验中心 引言 核酸提取质量管理 ?性能验证 试剂性能验证记录应能反映该批试剂的核酸提取效率 和核酸扩增效率。 可采用凝胶电泳试验比较核酸提取物与核酸标准物确 认核酸片段提取的完整性、260nm紫外波长测定确认核酸提 取的产率、260nm/280nm比值 确认核酸提取的纯度。 ?检验过程 应使用验证过的核酸抽提和纯化方法。 重庆市临床检验中心 核酸质量综合评价 产率 纯度 完整性 其他 ?其他：干扰物质、交叉污染等 重庆市临床检验中心 DNA核酸提取评价 产率 (yield) 1 核酸定量 评 2 提取核酸后进行定量PCR，比较Ct值 价 方 3 通过标本倍比稀释后提取进行灵敏度评价 法 4 通过内标(Internal Control/Calibrator)评价 重庆市临床检验中心 DNA核酸提取评价 产率 (yield) 核酸定量分析方法 若不含脂肪组织，大于10mg的组织应能产出大于 10 μg的 RNA 或 DNA 。 CLSI-MM10-P Genotyping for Infectious Diseases:Identification and Characterization . CLSI- MM13A Collection, Transport, Preparation, and Storage of Specimens for Molecular Methods. 重庆市临床检验中心 DNA核酸提取评价 产率 (yield) 检测260nm 、（320nm）OD值计算浓度 Q=(A260 – A320) ×50 × 稀释因子× 复溶体积/样本体积(ng/μl) 不同核酸提取方法产率比较 （不同提取方法提取核酸量比较） 重庆市临床检验中心 Clinic