归纳PCR技术原理.pptVIP

对标本的纯度要求低 不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测 演示课件 热启动PCR Touch-down PCR RT-PCR 兼并引物PCR 巢氏PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 连接酶链反应 RACE-PCR AFLP 免疫-PCR(immuno-PCR) MSP甲基化特异PCR 演示课件 1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板；制备杂交探针； 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型 演示课件 高浓度引物 低浓度引物 演示课件 2)反向PCR (reverse PCR) 用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段，对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 未知序列 未知序列 已知序列 演示课件 已知序列 未知序列 未知序列 限制酶 限制酶 连接酶 演示课件 3）多重PCR（复合PCR） 用于检测特定基因序列的存在或缺失。 演示课件 电泳 引物 1 2 3 4 1 2 3 4 演示课件 4）LP-PCR（Labelled primers) 利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物进行标记, 用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分 演示课件 标记引物 ＰＣＲ 观察 PCR产物 演示课件 5）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 锚定PCR首先合成第一链cDNA,然后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内切位点polydC)一起作PCR扩增 演示课件 PCR技术总论 演示课件 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。 聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。PCR又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。 70年代初，Kleppe等人就提出了PCR的工作原理。Saiki（1985）和Mullis（1986）两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因。当时的PCR技术须在每次变性和退火后，扩增反应前重新加入DNA聚合酶。1988年，由于在PCR系统引入了热稳定的TaqDNA聚合酶，这是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中提取的耐热DNA聚合酶，简称Taq DNA聚合酶。多次循环后的Taq DNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。 PCR基本原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。(Plateau)。 到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 。  PCR原理 Sample denaturatation Primer annealing Primer extension 演示课件 PCR product 演示课件 PCR反应曲线 演示课件 标准的PCR反应体系 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 10～100pmol 模板DNA 0.1～2