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P OH dNTP ddNTP P OH OH P P P P OH 演示课件 双脱氧链末端终止法测序原理示意图 演示课件 Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。 演示课件 1.3 荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Sanger原理，用荧光标记代替同位素标记，并用成像系统自动检测，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。 目前，应用最广泛的应用生物系统公司(applied biosystems ，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。如ABI3730XL测序仪拥有96道毛细管，4种双脱氧核苷酸的碱基分别用不同的荧光标记，在通过毛细管时不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被CCD检测系统识别，并直接翻译成DNA序列。 演示课件 目前所用自动测序技术的改进 演示课件 3730全自动测序仪 演示课件 1.4杂交测序技术 该方法不同于化学降解法和Sanger法，是利用DNA杂交原理，将一系列已知序列的单链寡核苷酸片段固定在基片上，把待测的DNA样品片段变性后与其杂交，根据杂交情况排列出样品的序列信息。 杂交测序检测速度快，采用标准化的高密度寡核苷酸芯片能够大幅度降低检测的成本，具有部分第二代测序技术的特点。但该方法误差较大，且不能重复测定。 演示课件 通过几十年的逐步改进, 第1 代测序仪的读长可以超过1000 bp, 原始数据的准确率可以高达99.999%, 测定每千碱基序列的成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到600000 碱基。 演示课件 第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。 随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代DNA测序技术的诞生。新一代测序技术即第二代测序技术。 演示课件 2、第二代DNA测序技术 第二代测序技术，主要包括罗氏454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的Solexa Genome Analyzer测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。 第二代测序技术最显著的特征是高通量,一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序,使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。 演示课件 第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头,随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上,这些反应就能够大规模平行进行,每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行,从而获得测序数据。DNA序列延伸和成像检测不断重复,最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。 第二代测序技术包括：454测序技术、Solexa测序技术和SOLiD测序技术。 演示课件 2.1 454测序技术 原理：在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶的作用下，将每一个dNTP的聚合与一次化学发光信号的释放偶联起来，通过检测化学发光信号的有无和强度，达到实时检测DNA序列的目的。 演示课件 演示课件 454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台Genome Sequencer 20，并测序了支原体Mycoplasma genitalium的基因组。 并在2007年推出性能更优的第二代基因组测序系统一Genome Sequencer FLX System(GS FLX)。罗氏在2005年便与454公司洽谈并购事宜，2007年完成并购，紧接着公布了DNA双螺旋的发现者之一——沃森(Jim Watson)的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。 演示课件 2.2 Solexa测序技术 核心技术：“DNA簇”和“可逆性末端终止” 。 原理：将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在Flow cell上形成了数以亿计Cluster，每个Cluster是具有数千份相同模板的单分子簇。然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性终止的SBS（边合成边测序）