PCR技术(环境微生物)资料.pptVIP

PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。 反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期， 即出现“停滞效应” ，这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多 数情况下，平台期的到来是不可避免的。 演示课件 双链DNA分子 演示课件 双链断开 循环1 演示课件 模板与引物结合 循环1 Taq Taq 演示课件 循环1 Taq Taq 演示课件 循环1 演示课件 循环1 演示课件 双链断开 循环2 演示课件 模板与引物结合 循环2 Taq Taq Taq Taq 演示课件 循环2 演示课件 94℃变性 双链断开 循环3 演示课件 循环3 Taq Taq Taq Taq Taq Taq Taq Taq 演示课件 循环3 演示课件 循环n 演示课件 PCR扩增的特异性是由一对寡核苷酸引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起使模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5’ 端之间的DNA片段。 演示课件 标准的PCR反应体系：  10×扩增缓冲液 　 10ul  4种dNTP混合物 　 各200umol/L  引物 　　　　 　 各10～100pmol　  模板DNA 　　　 　0.1～2ug　 Taq DNA聚合酶 　 2.5u　  Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L  加双或三蒸水至 　100ul  演示课件 三、PCR的成分和作用： 1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl （三氨基甲烷）(pH8.4) 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl 促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA) 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。 演示课件 2. MgCl2: 1.5 ～ 2.0 mM Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，过量能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。 演示课件 3. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP——底物 0.02 ～ 0.2 mM dNTPs 可与 Mg2+ 结合，应注意Mg2+ 浓度与dNTPs 浓度之间的关系， Mg2+ 浓度比 dNTPs 浓度高 0.2 ～ 2.5 mM。 过高：加快反应速度，还可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。 过低：反应速度下降，可提高实验的精确性。 演示课件 4. 引物 (Primer-P)： 预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异性。 0.2 ～ 1 μM 偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间 形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。 演示课件 5. Taq DNA 聚合酶：耐高热 0.5 ～ 5 U / 100 μl 1U / 25 ～ 50μl 偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低 演示课件 6. 模板DNA (Template): 最低102 ～ 105 bp DNA片段，实际用量远远 超过此量，用量需在实验中摸索。1 ～ 5 μl 过高：非特异产物增加 过低：产量降低 7. 水： 去离子水，补足整个反应体积。 演示课件 PCR实验 实验材料 1·模板：细菌DNA 2· TagDNA聚合酶 3·dNTP混合液 4·10倍浓度PCR缓冲液 5·2.5mmol/LMgCl2 6·RAPD引物：S14 S15 S18 S66 S74 S88 S97 S103 S110 S115 7·提取细菌DNA的相关试剂 演示课件 操作步骤 1．细菌染色体DNA的提取 2．RAPD反应体系的配置 演示课件 演示课件