琼脂糖凝胶电泳实验报告.docVIP

实验一：琼脂糖凝胶电泳对DNA提取 实验目的：学习使用水平式琼脂糖凝胶电泳进行DNA的提取。 实验原理： 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用生物染料嵌入DNA分子后在紫外下显色。1）在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极迁移。由于糖——磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。2）在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量和不同构型的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。3）生物染料在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，生物染料从正极向负极移动，就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在生物染料足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。 实验材料：微量移液器(2μl和4μl)，高压灭菌锅，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置，微波炉等。TAE电泳缓冲液 ，琼脂糖凝胶，PCR扩增样品 实验步骤： 1胶液的制备：称取0.2g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中, 加入20ml TAE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，沸腾。取出摇匀。加热时应盖上封口膜, 以减少水份蒸发。 2胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用透明胶带(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子。 3向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中小心地倒入胶槽内, 使胶液形成均匀的胶层。检查有无气泡。 4室温下约20分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，注意不要损伤梳底部的凝胶，清除碎胶。将凝胶放入电泳槽中。 5加入电泳缓冲液（TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。 6加样：取2μlPCR样品与2μl 缓冲液液混匀, 用微量移液枪小心加入样品槽中。小心操作, 避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。7电泳：加完样后，插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至160V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。8当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约1cm时，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳。9取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。在波长为302nm紫外灯下拍照观察。 实验结果: 利用琼脂糖凝胶电泳实验做的图如下： 结果分析：通过跑胶结果可以看出DNA的分离效果都很好，无断裂，浓度可观，点样位置为第一排第16个，即第一排最后一个。与Mark的对照有相吻合的条带，可进行下一步的判断与分析。 注意事项 1确保实验全程无污染 2缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高 离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致 DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间 高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。 ? 3凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。 ? 4样品加入量：加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。 ? 5电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。