基因组DNA提取与PCR技术教案.ppt

PCR反应条件的控制 PCR反应成分 1.PCR反应的缓冲液：10-50mmol/L Tris-Cl 缓冲液，72℃ 时pH7.2,调节反应体系的pH值，使Taq DNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。缓冲液含50mmol/L的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入适量二甲基亚砜或甲酰胺有利于破坏模板的二级结构。 演示课件 Taq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。 在PCR反应中，Mg2+的总量应比dNTPs的浓度高。 其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。 常用1.5mmol/L 。 2.镁离子浓度：1.5mmol/L 演示课件 dNTP溶液具有较强的酸性。使用时应用NaOH将pH值调至7.0-7.5，分装小管，于-20℃存放，过多冻融会使dNTP产生降解。 在PCR反应中，dNTPs浓度在20-200μmol/L, dNTP浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种dNTP在使用时必须以等摩尔数浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率。 3.底物浓度：20-200μmol/L 演示课件 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键的因素之一。PCR发明的初期使用的DNA聚合酶是Klenow片段、T4DNA聚合酶和T7DNA聚合酶，它们因对热的稳定性差而未得到广泛应用。直到耐热的DNA聚合酶(Taq DNA polymerase) 应用于PCR反应，才使这一技术得到迅速发展和广泛应用。  4.耐热DNA聚合酶：2.5-5 u 演示课件 TaqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在75-80℃具有最高的聚合酶活性。75-80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸，70℃时延伸速度在60个核苷酸/秒以上。55℃时为22个核苷酸/秒；37℃和22℃时分别为1.5个和0.25个核苷酸/秒。温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关。 演示课件 Taq DNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%～0.25%。Taq DNA聚合酶体外扩增DNA的忠实性是所有已知忠实性的DNA聚合酶中最低的。因此在特别考虑扩增产物忠实性，推荐采用具有校对功能的其他耐热的DNA聚合酶。如Vent和Pfu DNA聚合酶。 演示课件 Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但对4种dNTP聚合到3′-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A。我们利用它的这种特性，在构建T载体时，在反应体系 中只加一种底物，即只加dTTP。此酶就催化在载体末端加上dT,这种载体即可直接用来克隆PCR 产物。 演示课件 核酸分为两大类 脱氧核糖核酸（DNA） Deoxyribonucleic Acid 核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid。 演示课件 脱氧核糖核酸（DNA） DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大 DNA结构 演示课件 核糖核酸（RNA） RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。RNA为单链分子。 演示课件 核酸的理化性质 RNA核苷酸的纯品呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 演示课件 核酸的理化性质 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA 时，先把DNP抽提出来，再把P除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA 。 演示课件 核酸的理化性质 DNP和RNP在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。DNP在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很