第五章分子生物学研究方法上生物大分子操作技术.pptVIP

2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 32 第三节 RNA 操作技术 2. mRNA 的纯化 ? mRNA 的分离方法较多，其中以寡聚（ dT ） - 纤维素柱层析 法最为有效，已成为常规方法。 ? 利用 mRNA 的 Poly A 结构，试剂盒提供一种生物素化寡聚 dT 引物，与 Poly A 杂交，形成生物素化寡聚 dT-mRNA 的杂交 体，然后利用生物素与抗生物素蛋白的结合作用以链抗生物 素 - 顺磁颗粒（ SA-PMPs ）结合杂交体，形成生物素化寡聚 dT-mRNA-SA-PMPs 复合物，再利用磁性吸附作用以磁性条 吸附复合物中的 SA-PMPs 颗粒，最后利用高严紧度盐溶液 中分子杂交体磁性减弱，杂交体中生物素化寡聚 dT 引物与 mRNA 分离，从而纯化得到 mRNA 。 2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 33 PolyATtract mRNA 的分 离纯化过程 简图 2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 34 第三节 RNA 操作技术 3. cDNA 的合成 ? cDNA 的合成包括第一链和第二链 cDNA 的合成。第一链 cDNA 的合成是以 mRNA 为模板，反转录为 cDNA ，有反转 录酶催化，该酶合成 DNA 时需要引物引导，常用引物是 oligo dT 。第二链合成是以第一链为模板，由 DNA 聚合酶催 化。 2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 35 第三节 RNA 操作技术 4. cDNA 文库的构建 ? cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经 反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的 集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆 转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当 的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 ? 步骤：在获得高质量的 mRNA 后，反转录合成 cDNA ，合成 接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插 入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定 。这里强调的是对载体的选择，常规用的是 λ 噬菌体，这是 因为 λ DNA 两端具有由 12 个核苷酸的粘性末端，可用来构 建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA 。 2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 36 第三节 RNA 操作技术 5. 基因文库的筛选 ? 基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出 含有所需重组 DNA 分子的特定克隆的过程。筛选方法有很多 种，常用的有： ? 核酸杂交法 ? PCR 筛选法 ? 免疫筛选法 2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 37 第四节 基因克隆技术 ? 在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（ clone ）表 示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群 体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（ monozygotic twins ）便是属于同一克隆。 ? 在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（ progenitor cell ）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。 ? 在分子生物学上，人们把将外源 DNA 插入具有复制能力的载 体 DNA 中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。 2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 38 第四节 基因克隆技术 1. RACE 技术 ? 是用于从已知 cDNA 片段扩增全长基因的方法，它根据已知 序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行 PCR 扩增得到目的序列。用于扩增 5 端的方法称为 5 RACE ，用 于扩增 3 端的称为 3 RACE 。 ? 已知 cDNA 序列可来自序列表达标签、减法 cDNA 库、差法 显示和基因文库筛选。 2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 39 第四节 基因克隆技术 1. RACE 技术 ? 5 RACE ? 在反转录酶的作用下，以已知基因 片段内部。特异性引物启始 cDNA 第一条链的合成 ? RNase 混合物降解模板 mRNA ，纯 化 cDNA 第一条链。 ? 用末端转移酶在 cDNA 链 3 ‘ 端加入 连续的 dCTP ? 以连有 oligo(dG) 的锚定引物和基 因片段内部特异的 nested 引物进行 PCR 扩增，以期得到目的片段，并 可用 nest PCR 进行检测。 2020/4/2 南京农业大学 生命科学学院 40 第四节 基因克隆技术 1. RACE 技术 ? 3 RACE ? 是在反转录酶的作用下，以连有可 以和 polyA 配对的 oligo(dT) 的锚定 引物启始 cDNA 第一条链的合成。 ? 用 RNaseH 降解模板 mRNA