实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法专业知识讲座.pptVIP

文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 Please be quiet, 上课了！！ 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 1 、学习利用考马斯亮蓝 G-250 染色法测定蛋白质 含量的原理及方法； 2 、掌握分光光度计的使用方法； 3 、掌握标准曲线的绘制。 一、实验目的： 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 考马斯亮蓝 G-250 在酸性溶液中游离状态下为 棕红色 。 当它与蛋白质通过范德华键结合后变为 蓝色 . 蛋白质染料复合物对 595nm 可见光有最大光吸收 . 在一定范围内（ 10 -1000ug/ml ）其 OD 595nm 值与 蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的 定量测定。 二、实验原理： 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 考马斯亮蓝 G-250 染色法原理 465 nm 595 nm 酸性环境下呈 棕红色 与蛋白质结合 变蓝色 加入 蛋白质 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 双缩脲反应： Folin- 酚试剂法（ Lowry 法）： 紫外吸收法： 微量凯式定氮法： 其他蛋白质含量的测定方法 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （ 1 ）双缩脲法： 原理是蛋白质含有两个以上的肽键（ -CO-NH- ） 因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与 Cu 2+ 形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比， 故可以用来测定蛋白质含量 . 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （ 2 ） Folin- 酚试剂法（ Lowry 法）： 是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液 中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原 磷钼酸－磷钨酸试剂，产生 深蓝色 （钼蓝和钨蓝 混合物）比双缩脲法灵敏，但费时； 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （ 3 ）紫外吸收法： 蛋白质中 Trp ， Phe ， Tyr 的残基中的苯环含有 共轭双键，吸收高峰在 280nm 处，所以蛋白质具有吸 收紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其 含量成正比，可用作定量测定。 简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干 扰。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 （ 4 ）微量凯式定氮法 ： 根据蛋白质的平均含氮量为 16% ，因此， 测得 1g 蛋白氮，相当于 6.25g 蛋白质 。 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 1 、 实验材料： 豆芽 2 、仪器： ( 1)S-22pc 可见光分光光度计 (2) 研钵 (3) 离心机 (4) 试管 (5) 容量瓶等 3 、试剂： （ 1 ）染色液：考马斯亮蓝 G-250 (100mg 考马斯亮蓝溶于 50ml 95% 乙醇，加 100ml 85% 磷酸，加水 稀释至 1L) （ 2 ）浓度： 0.25mg/ml 的牛血清白蛋白标准溶液。 三、实验材料、仪器和试剂： 文档来源于网络，文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模 仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。 1 、制作标准曲线： 取 7 支试管，依次分别加入 0.0 ， 0.10, 0.15, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml 的牛血清蛋白溶液，用水 补足到 0.5ml ，每管均再加 5ml 染色液，立即摇 匀，置室温下放置 5 分钟。然后测各管的 OD