细胞凋亡及其检测方法.pptxVIP

细胞凋亡及其检测方法;1885年 Flemming——退行性卵泡上皮细胞的染色质聚集成半月状或固缩成小体状； 1886年 Nissen——在哺乳期乳腺中观察到类似改变； ;Sydney Brenner 西德尼?布伦纳 ;研究细胞凋亡的意义;王晓东教授主要研究成果集中在对于哺乳动物细胞凋亡的生化调控机制和信号通路的研究。2004年4 月21 日当选为美国科学院最年轻的院士。 ;教学目的 1、掌握细胞凋亡的特征。 2、通过对细胞凋亡检测方法的学习，能结合本专业完成研究细胞凋亡的实验设计。;细胞凋亡的定义;细胞凋亡的诱因 1;细胞凋亡的抑制因素;细胞凋亡的特征性变化—形态学 ;(续)形态学变化;细胞凋亡的特征性变化—生物化学;细胞凋亡的特征性变化—生物化学;细胞凋亡的特征性变化—生物化学;（四）胞浆pH值的变化 1、胞浆酸化主要通过激活酸性DNaseⅡ启动细胞凋亡； 2、[pH]i降低也增强了一些酸性蛋白质功能，如转谷氨酰胺酶、酸性鞘磷脂酶； 3、减弱细胞的呼吸爆发作用，生成与细胞凋亡相关的活性氧（reactive oxygen species,ROS）。 4、胞浆碱化可激活碱性核酸内切酶启动细胞凋亡。 ;细胞凋亡时线粒体的变化;细胞凋亡与坏死的区别;细胞凋亡的基本过程 ;细胞凋亡信号转导分子;;Bcl-2家族;(apoptosis inducing factor) ;Bcl-2抑制凋亡的可能机制;IAP Inhibitor of apoptosis Proteins ;神经细胞凋亡的研究模型;Morphological Changes of Astrocytes under Ischemia;神经细胞凋亡的检测方法 ;研究方法的分类;（续）研究方法的选择;三、根据样本来源不同选用不同的方法 1、组织 对活检组织或手术标本主要用形态学的 方法如HE染色，透射电镜，还可以进行石蜡 包埋组织切片行原位末端标记。也可作ELISA 和将组织碾碎消化作琼脂糖凝胶电泳。 2、培养细胞 对细胞株或原代培养的细胞几乎所 有的方法都可用。 ;细胞凋亡的检测方法;(Electron Micrograph);常规琼脂糖凝胶电泳检测DNA Ladder;常规步骤;琼脂糖凝胶电泳的定量检测 ;常规步骤;原位末端标记技术 ;常用原位末端标记技术;常用的标记物和显示系统;神经细胞凋亡的检测方法----ISNT ;缺口平移法;ISNT结果判断;神经细胞凋亡的检测方法----TUNEL ;在目前常用???剂盒中，多用TdT酶催化DNA单链和双链3‘-OH末端非模板依赖性的Br-dUTP掺入反应。用荧光标记的BrdU抗体进行细胞染色后，用流式细胞仪来检测，即可得到细胞凋亡结果。 与其他标记物相比（荧光素、生物素或地高辛）， Br-dUTP更容易掺入凋亡细胞的基因组中。;(TUNEL Staining);原位末端标记技术注意事项 ;流式细胞仪FLOW CYTOMETER; 散射光信号;流式细胞仪检测凋亡细胞的原理;常用荧光染料的特性;用于流式细胞仪检测的荧光染料;Annexin V 检测细胞凋亡;;凋亡细胞的TUNEL流式细胞仪分析;常规步骤;优 点;非固定细胞的染色方法;;细胞凋亡调控基因表达产物的FCM检测 ? Apo 2·7 ? bcl-2 ? P53 ? Fas及FasL ? Caspase(半胱氨酸蛋白酶) ;思考题 1、名词解释：细胞凋亡； 凋亡小体 2、细胞凋亡的形态学、生化学有哪些改变？与 坏死有哪些区别？ 3、 Annexin V 检测早期细胞凋亡的原理。 4、原位末端标记技术检测细胞凋亡的原理。