3蔗糖酶蛋白含量测定及活力测定.docxVIP

沖沪丿冷实验报告 专业： 姓名： 孙程珂 学号： 3150100531 课程名称：生物化学实验（甲） 同组学生姓名： 指导老师：杨劲树 成绩： 日期： 地点： 一、实验目的和要求 三、实验材料和主要仪器 五、实验数据记录和处理 . 、 四、 六、 实验内容和原理 实验方法和步骤 实验结果和分析 七、实验讨论和心得 i 一、实验目的和要求 j 1、学习Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法； : 2、掌握分光光度法制作标准曲线，准确测定未知样品的蛋白质含量； : 3、掌握分光光度计的使用方法。 j 4、掌握酶活力测定的基本原理和方法； \ 5、学习酶的比活力的计算。 — 二、实验内容和原理 装 Folin-酚测定法是在双缩脲反应的基础上发展起来的， Folin-酚试剂是由甲、乙两种试剂组成的。甲试剂由 碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜和酒石酸钾钠组成，在碱性条件下蛋白质中的肽键与酒石酸钾钠铜盐起作用，生成 订 紫红色络合物；乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成，在碱性条件下，铜 -蛋白质络合物以及蛋白质中 的酪氨酸残基（酚基）和色氨酸还原磷钼酸 -磷钨酸试剂（乙试剂）产生深蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物），其色 线 泽深浅与蛋白质含量成正比。可用 500nm波长比色测定，适于测定蛋白质含量 0.05?0.5g/L. 优点：简单、迅速、灵敏度高；反应较稳定。 ? 缺点：该反应受多种因素的干扰。 f 蔗糖酶（B -D-咲喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖） f 的1,2-糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解 1mol蔗糖，就能生成 2mol \ 还原糖。还原糖的测定有多种方法，例如：纳尔逊—索模吉（ Nelson-Smogyi ）试剂比色法，斐林试剂法等。 : 本实验采用3.5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量，由此可得岀蔗糖酶水解速度。其原理是 3.5—二硝基水杨 ： 酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。因此可 : 利用分光光度计在 500nm进行比色测定，求得样品中的含糖量。此法操作简便、迅速、杂质干扰较小。 j 蔗糖酶活力单位（u）: j 蔗糖酶在室温（50 °C） , pH4.5的条件下，每分钟水解产生 1卩mol葡萄糖所需的酶量（ml）。 i 蔗糖酶比活力的计算： j 酶的比活力一一为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位 /mg蛋白质表示。酶的比活力 j 在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用 f 来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。 j 比活力一一酶的总活力单位数除以总蛋白 mg数，即每 mg蛋白所含有的酶活力单位数。 比活力二活力单位/mg蛋白 实验名称： 姓名： 学号: 三、实验材料和主要仪器 1、 实验材料 蔗糖酶提取的各步分离纯化样品I、n、皿、w。 可根据样品溶液的蛋白质含量高低作适当的稀释。 2、 实验试剂 ⑴Folin-酚测定法： 标准蛋白质溶液：0.5g/L牛血清白蛋白 Folin-酚试剂(甲试剂、乙试剂) 3,5-二硝基水杨酸比色法： 1g/L葡萄糖标准溶液(葡萄糖相对分子量 198.17) 5 %蔗糖溶液 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 3,5 -二硝基水杨酸试剂( DNS ) 3、 实验器材与仪器 恒温水浴(50C、100 °C)； 可见光分光光度计、 1cm玻璃比色皿； 试管、试管架； 移液管； 微量移液器： 200卩l、1000卩l P.2四、实验方法和步骤 P.2 1、制备Folin-酚法蛋白质标准曲线 试管号 1 2 3 电 5 ￡ 标旌蛋白质含量 0 (k 1 0_工 0.3 乱4 Q-5 0. bg/L标准蛋白质常液Cml) 0 0.2 Q.4 0.6 GlB 1 釉水 (?1 I 0.R 0.6 0.4 0.2 0 Folin-酚试刑甲 nl 5 5 E 5 6 B 規匀，在室下静BtlPrain Folin 试剂有 CnL) 0.5 Q.5 6 5 乩5 机 0.5 混匀［加一苛闹一苛),在室温(25X?)下罪置SOnih 0 6 162 0+ 330 0.167 0.580 (k S95 以光吸收值(A500)为纵坐标，标准蛋白质含量( mg为横坐标，绘制蛋白质标准曲线 2、各步分离纯化的样品蛋白含量测定 表2 (4倍稀释：样品0.25ml+蒸馏水0.75ml ) ft品 ft品 空白 n ”倍甸 11「“倍稀禅） 轴号 1 2 3 4 6 7 0 9 10 11 12 13 样品龍 0-0 0.05 0.2 0.S 0