生物工程下游技术电泳分离技术.pptxVIP

第十四章 电泳分离技术;前 言;电泳是指带电粒子在电场的作用下，向着与其电性相反的电极移动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 ;u:泳动度or泳动率(cm/伏·秒or分) V:泳动速度:cm/秒or分 E:电场强度:伏特/cm ;(2)影响泳动率u的因素 内因：1.净电荷 2.质点大小 3.质点形状 外因：1.V ( U/L) 2.缓冲液的pH (pH恒定) 3.离子强度[I] 最适:0.02-0.2 4.电渗：液体对固体支持物的相对移动; (3)电泳类型 a.载体电泳 纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、粉末电泳、细丝电泳、 凝胶电泳。 凝胶电泳包括：琼脂糖凝胶、淀粉凝胶、硅胶凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳包括：垂直板、盘状、等电聚焦、梯度、免疫电泳 b.自由界面电泳 支持物为溶液，很少用。;2.聚丙烯酰胺凝胶电泳;;;光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。 化学聚合：制小孔胶。 过硫酸铵(NH4)2S2O3 APS (引发剂) N,N,N,N’-四甲基乙二胺，TEMED(加速剂);2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;（1）样品浓缩效应：由凝胶系统的不连续性产生。 ①凝胶孔径不连续性 ②缓冲液离子成份的不连续性 ③pH的不连续性;①凝胶孔径不连续性 单体浓度 交联度 大孔胶:T=3% C=2.0% 小孔胶:T=7% C=2.5%;凝胶网孔大小: 聚合链长度:由Acr浓度 交 联 程度:由Acr与Bis相对比例 Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比 如: Acr Bis T(%) 小孔 28.0g 0.735g 7% 大孔 10.0g 2.5g 2.5%;;②缓冲液离子成份的不连续性 大孔胶 pH=6.7 先行离子：Cl-存在于凝胶层中任何pH值下 随后离子：Gly-存在于电极缓冲液中 pI=6.0 pKα1=2.34 pKα2=9.70 在pH=6.7时，只有少数解离为Gly-，多数为Gly+-。 Pr分子在pH6.7时以Pr-形式存在 ;③pH的不连续性 pH 大孔(浓缩)胶 6.7 小孔(分离)胶 8.9 缓冲液 8.3 ; A为电泳前3层凝胶排列顺序???3层胶中均有快离子、慢离子 B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢离子之间被浓缩成极窄的区带。 C显示蛋白质样品分离成数个区带。;不连续系统浓缩效应示意图;连续胶与不连续胶: 连续胶：胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份不变 不连续胶:胶条(胶板)的浓度、pH值、组成成份变化;;;;变性胶与非变性胶： 变性胶：胶电脉在蛋白质变性的状态下进行， 主要指SDS变性条件下进行。 非变性胶：电泳在蛋白质保持天然状态下进行，不加变性剂。;;;电泳装置;图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)(1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3;架膜;实验操作： 浸泡 将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和麻面。 点样 用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜麻面一端2cm处画一细线，利用载玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。 电泳 将薄膜麻面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；通电后先使U=80V，待10min后，使U=120V电泳40min。 染色 将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重染色10min。 漂洗 将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无蓝黑色。;4.等电聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF);原理（续） 当Pr在电场中迁移到它的PI时