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第三节 外植体的选择与培养 一、外植体的选择： 种质优良 植株健壮 取材的最适时期 适宜的大小 选材 第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术 . * 二、外植体灭菌 1：对材料进行预处理 2：材料表面灭菌： 1）水洗,滤纸吸干; 2)70%酒精浸30～60s; 3）用灭菌剂处理; 4）用无菌水冲洗. 第三节 外植体的选择与培养 . * 表面灭菌剂的种类较多，可选取1—2种使用。 灭菌剂 使用浓度(%) 持续时间（min） 去除的难易 效果 次氯酸钙 9~10 5~30 易 很好 次氯酸钠 2 5~30 易 很好 氯化汞 0.1~1 2~10 较难 最好 抗菌素 4~50mg/L 30~60 中 较好 常用灭菌剂使用浓度及效果比较表 第三节 外植体的选择与培养 . * 三、外植体的接种与培养 （一）接种—无菌操作 定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到无菌培养基上，这一过程叫做接种。 第三节 外植体的选择与培养 . * (1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (2)接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷雾降尘，并擦拭工作台面； (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95%酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。 第三节 外植体的选择与培养 接种前的准备工作： . * (1)对接种材料进行消毒； (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒精火焰上方转动，灼烧数秒钟； (3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入或放在培养基表面； (4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟； (5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等； (6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。 第三节 外植体的选择与培养 接种时的无菌操作技术： . * （二） 外植体培养 外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。 第三节 外植体的选择与培养 . * 培养的环境条件: 温度 氧气 湿度 光照 培养室 培养条件 第三节 外植体的选择与培养 . * 定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个过程叫做继代培养。 第三节 外植体的选择与培养 . * 四、外植体成苗途径 1、外植体→愈伤组织→根、芽→试管苗 ①同时长芽和根 ②先长芽，再长根 ③先长根，再长芽 2、外植体→胚状体→试管苗（胚状体途径） 3、外植体→根、芽→试管苗（器官发生途径） 第三节 外植体的选择与培养 . * 外植体 愈伤组织 胚状体 芽、根 根、芽 芽 芽 根 根 试管苗 外植体成苗途径： 第三节 外植体的选择与培养 B A C . * (1)、直接从器官上发生(2)、从愈伤组织发生(3)、从游离的单细胞发生(4)、从小孢子发生 (1)数量多 (2)速度快 (3)结构完整 第三节 外植体的选择与培养 胚状体的产生途径： 诱导胚状体比诱导芽的优点： . * 五、培养过程中常出现的问题 及解决方法 第三节 外植体的选择与培养 污染 褐变 玻璃化现象 组织培养三大难题 . * 第三节 外植体的选择与培养 1、污染原因 细菌污染 真菌污染 （一）污染 真菌污染 . * 2、污染的预防措施 第三节 外植体的选择与培养 (1)减少或防止材料带菌(2)外植体灭菌要彻底(3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌(4)布质制品的灭菌(5)无菌室的消毒(6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进行接种。 . * 1、定义： 是指外植体在培养中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响材料的培养。 第三节 外植体的选择与培养 （二）、外植体的褐变 . * ①植物品种 ②生理状态 ③培养基成分 ④培养条件不当 第三节 外植体的选择与培养 2、褐变的主要原因 . * ①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭 第三节 外植体的选择与培养 3、减轻褐变现象发生的措施 . * （三）玻璃化现象 1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状，这种现象称为玻璃化。 第三节 外植体的选择与培养 . * 2、玻璃化现象产生的原因 细胞分裂素浓度较高时； 琼脂浓度低时； 温度低