PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理.ppt

. . PCR技术及临床应用、新冠病毒核酸检测原理 授课人：刘翔宇 目 录 核酸基本知识 PCR的发展史 PCR技术简介 实时荧光PCR技术 实时荧光PCR的临床应用 新冠病毒核酸检测原理 一、核酸基本知识 核酸：生物贮存遗传信息物质的大分子，是生命的直接标志 核酸的分类：脱氧核糖核酸（DNA），核糖核酸（RNA）。DNA和RNA的区别在于：DNA所含的戊糖为脱氧核糖，而RNA所含的戊糖为核糖；在碱基成分中，DNA含胸腺嘧啶T，而RNA含脲嘧啶U。 核苷酸：是核酸的基本结构单位，核酸水解首先得到的是单核苷酸，后者可进一步水解为核苷和磷酸，核苷可进一步水解为戊糖（核糖和脱氧核糖），和含氮碱基（嘌呤碱和嘧啶碱）。 核酸的基本结构 遗传信息传递的中心法则 DNA的复制：能在酶的作用下解链，根据碱基互补配对的原则进行半保留复制。 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。 二、PCR的发展史 1953年，沃森和克里克发现了DNA双螺旋的结构，开启了分子生物学时代，极大地推动了核酸生物化学,分子生物学及分子遗传学等各类生命科学的迅速发展。 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。  1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶，此酶的发现使PCR广泛的被应用。 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、PCR污染少、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 第一代：手动/机械手式水浴基因扩增 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴。 这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件。 第二代：自动化控制型PCR 使用广泛及具有代表性，采用琼脂糖电泳的方式对PCR产物进行分析，但存在着操作繁琐、只适用于定性研究、交叉污染风险大等不足。且无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 第三代PCR：实时荧光定量PCR 为了避免上述传统PCR的缺陷，并对基因的表达水平进行定量分析，1992年诞生了所谓“第三代PCR的荧光定量实时PCR。 所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 第四代PCR：数字PCR 由于定量PCR的分析最终结果依赖于Ct值，在这个意义上所谓的“定量”也只是相对的。而且在低拷贝靶分子、模板浓度差异细微的条件下，其检测的灵敏度、精确度都受到了限制。在这种背景下，“数字 PCR应运而生。 数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于实时荧光定量PCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。 因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。 三、PCR技术简介 高温可以使双链DNA解链成为单链，这一过程称为变性。 变性后的DNA通过降温可以重新接合为双链，这一过程称为复性。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，它的特异性取决于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 利用温度的升降来控制DNA的变性和复性。 设计引物作为启动序列，加入DNA聚合酶、dNTP（三磷酸脱氧核甘酸）等原料完成特定基因的体外复制。 周而复始的升降温度进行扩增，每一循环可以使靶序列增加一倍。 PCR扩增步骤 DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。 退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。 延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，以dNTP（三磷酸脱氧核甘酸）为