b16黑素瘤细胞传代培养方法.docxVIP

细胞传代培养 一．仪器的清洗与消毒 （一）实验材料 仪器：倒置显微镜、 96 孔板、微量移液器（枪及枪头） 、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、 烘箱、牛皮纸、棉线、培养平皿、喷壶、脱脂棉、封口膜、培养瓶 100ml、点滴瓶 (250ml 、 500ml) 、烧杯（ 500ml、 50ml ）、量筒（ 500ml ， 100ml ， 10ml），滤器及滤膜（ 0.22um）酒精 灯、移液管、吸球、吸管架及瓶架、镊子、标签贴、液氮罐或冰箱冰柜、双蒸器、超净台、细胞冻存管 试剂：胎牛血清、 DMEM 培养基、胰蛋白酶、 PBS 液、 75% 酒精 (二) 清洗消毒方法 1.玻璃仪器 （1）新玻璃仪器 1%稀盐酸浸泡过夜——自来水冲洗（ 5-6 次）——洗涤剂清洗——自来水冲洗（ 5-6 —甩干——浸酸（瓶内不能有气泡） 过夜——自来水冲洗（ 20 次）——蒸馏水洗（  次）— 3-5 次） ——双蒸水洗（ 3 次）——烘干 5（ 0-60 摄氏度）——牛皮纸包装 2）用过的玻璃仪器 自来水浸泡——洗涤剂刷洗（以后同新仪器清洗步骤一样） 2.瓶盖 洗涤剂刷洗——自来水冲洗——蒸馏水浸泡过夜——双蒸水煮沸  2-3  次  1 次 /10/min ——烘 干——牛皮纸包装 3.剪刀镊子 洗涤剂刷洗——自来水冲洗——蒸馏水冲洗——酒精棉球擦拭  （用双蒸水与酒精配制）  —— 牛皮纸包装 4.试剂的除菌 使用  0.22um  微孔滤膜除菌，可以除去细菌及  2/3 的支原体。 二．实验方法 取小鼠 B16 黑素瘤细胞株， 用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基 10ml，在 37 摄氏度 5%CO 2 恒温培养箱中培养； 待细胞生长至将近铺满培养瓶底部时， 停止培养； 弃去培养液， 用 PBS 液清 5ml 洗细胞 2 次，弃去 PBS 液；用含 0.25%的胰蛋白酶 1ml 消化细胞 ,于倒置显微镜下 观察，待细胞收缩变圆时拿回操作台； 瓶外用酒精棉球消毒， 打开培养瓶盖， 倒去消化液 （先 倒去的先吹打） ，酒精棉球吸去最后一滴消化液，盖上瓶盖放置 2-3min。打开准备好的培养 基、带吸球的移液管，加培养基 20ml，对着细胞面加入，加的时候吸管口不可碰到培养瓶 口，加完后进行吹打，注意不要有太多气泡，吹打成单细胞悬液（一般基本 5-7 次），吹打 完成后可取少量进行细胞计数； 一般情况下， 细胞长的较快， 一瓶可以分成 3 瓶。打开经过 消毒的瓶子，分装，盖上瓶盖，并标记是由哪一瓶分出来的（什么细胞、时间等） ，用封口 膜封好， 在倒置显微镜下观察后放入 CO2 培养箱中培养。 培养后 2h 观察一次， 以后每天观 察一次，一般 3 天完成一次传代培养。传至 5 代是就要进行冷冻一次。