浙江大学生物化学甲实验课件实验9氨基移换反应及其产物的鉴定.pptVIP

实验九 氨基移换反应及其产物的鉴定 丁鸣 一、实验目的和要求 1 、学习鉴定氨基移换反应的简便方法及其原理； 2 、学习纸层析的原理和操作技术。 二、实验基本原理 1. 氨基移换反应： 在氨基移换酶（转氨酶 ) 的催化下，氨基酸的 α - 氨基 和 α - 酮酸的 α - 酮基 之间 发生的互换反应。 转氨酶的种类很多，任何一种氨基酸进行转氨作用时都由其专一的转氨酶催 化。转氨酶的最适 pH 接近 7.4 ， 在各种转氨酶中，谷丙转氨酶（ GPT ）和谷草 转氨酶（ GOT ）的活性最强。 转氨酶广泛存在于机体的各种组织中。在 肝、心、肾 等组织中 谷丙转氨酶 （ glutamic pyruvic transaminase, GPT ）、 谷草转氨酶 （ glutamic oxalacetic transaminase,GOT ）活性较高。 GPT 催化下的转氨基反应为： L －谷氨酸脱氢酶在体内特别是在肝细胞内含量丰富，活性高，催化 L －谷氨酸氧化脱－ NH 2 ，加碘乙酸能抑制其活性，从而可以保护氨基移换反 应的产物 L －谷氨酸。 本实验用纸层析法，检查由丙氨酸和 α— 酮戊二酸在肝细胞谷丙转氨酶 （ GPT) 的作用下所生成的谷氨酸，证明组织内的氨基移换作用。 2. 纸层析原理： 滤纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析。利用不同物质在两个互不 相溶的溶剂中分配情况（溶解度）的不同来分离混合物的一种技术。 层析溶剂是由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上羟基具有亲水性，因此吸附 一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作为流动相。进行分离时，由于被分 离物质的组分在两相中的分布不同，随着流动相的移动，物质将在两相间进 行连续的、动态的不断分配，从而造成不同组分移动的速度也不相同。易溶 于流动相中的组分移动快，在固定相中溶解度大的组分移动慢，于是得到分 离。 溶质在滤纸上的移动速率用 R f 值表示： 原点到溶剂前缘的距离 距离 原点到层析斑点中心的 值 ? f R 原点 溶剂前沿 样品层析斑点 X Y ⊙ ● Y X R f ? X —— 原点到层析斑点 中心距离 Y —— 原点到溶剂前沿 的距离 在一定的条件下某种物质的 R f 值是常数。 R f 值的大小与样品的性质、结构、 溶剂系统（溶剂的性质、溶剂的 pH ）、层析的温度和层析滤纸有关。 此外， 样品中的盐分，其他杂质以及点样过多皆会影响样品的有效分离。 用滤纸层析法分离氨基酸，是根据氨基酸样品的 R 基团的化学结构或极 性大小的不同，将样品氨基酸溶解在适当的溶剂（ 0.01mol/L pH7.4 磷酸缓 冲液）中，点样在滤纸的一端，再选用适当的溶剂系统（酚溶液），通过毛 细现象向另一端展层，展层完毕后，用茚三酮作为显色剂，即可得到氨基酸 样品的分离图谱。 3. 茚三酮的显色原理： 氨基酸 + 茚三酮类 紫红色复合物 80℃ 三、实验材料与试剂 1 、实验材料 动物肝脏 ( 牛蛙肝或猪肝） 2 、实验试剂 ⑴ 0.01mol/L 磷酸缓冲液（ pH7.4 ）（转氨基反应所需缓冲溶液）； ⑵ 0.1mol/L α －丙氨酸（ pH7.4 ）（转氨基反应的底物，纸层析的标准样品）； ⑶ 0.1mol/L α －酮戊二酸（ pH7.4 ）（转氨基反应的底物）； ⑷ 0.1mol/L 谷氨酸（ pH7.4 ）（纸层析的标准样品）； ⑸ 展层溶剂－酚溶液：水饱和酚：冰乙酸（ 300 ： 1 ）（纸层析用）； ⑹ 10 ％三氯乙酸（终止酶促反应，使转氨酶及其它蛋白质变性、沉淀）； ⑺ 0.25% 碘乙酸（抑制 L －谷氨酸脱氢酶活性）； ⑻ 显色剂（ 0.1% 茚三酮 - 乙醇溶液）。 四、实验器材与仪器 ⑴ 研钵； ⑵ 试管及试管架； ⑶ 恒温水浴箱（37℃、100℃）； ⑷ 铅笔、尺和圆规； ⑸ 毛细管（直径 0.5mm) ； ⑹ 新华定性滤纸（直径 11cm ）； ⑺ 剪刀和镊子； ⑻ 电吹风； ⑼ 滴管； ⑽ 康氏皿； ⑾ 喷雾器； ⑿ 烘箱（80 ℃）。 五、实验操作方法和步骤 1 、转氨酶液的制备