histag融合蛋白纯化(ida)_1243.docVIP

产品使用说明书 His·Tag 融合蛋白纯化操作手册 *建议同时参考本说明书英文原文（说明书编号TB054）。 采用 pET 系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到 20mg/100ml 培养物并不是困难的事。 在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周 质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进 行目的蛋白的细胞定位（请参考 pET 系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋 白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表 达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形 成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以 通过选择不同表达载体和 E.coli 宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表 达的目的。His·Tag?融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用 NTA His·Bind 树脂或 IDA His·Bind 树脂进行纯化。 内容提要 一、亲和纯化样品的前处理 1. 菌液体积-起始目的蛋白量 2. 细菌裂解获得可溶蛋白 ? BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法 ? 机械破碎（如超声等） 二、亲和纯化步骤 （一）IDA HisBind 树脂纯化 1. 散装树脂亲和纯化 ? 天然条件柱层析 ? 天然条件批次小量纯化 ? 变性条件的纯化 2. 其它常见 IDA 树脂产品形式的纯化 ? IDA His·Bind 预装柱纯化 ? IDA His·Bind Quick 柱和筒纯化 ? His·MagTM 琼脂糖磁珠纯化 3. 洗脱之后的样品处理 附录：补充背景知识 ? NTA 和 IDA 化学基团 ? 杂蛋白 ? His·Bind 基质选择指南 ? 如何降低非特异性结合 ? 在确定裂解方法前的考虑 ? 漂洗杂蛋白 ? 蛋白可溶性及细胞定位 ? 目的蛋白的洗脱 ? 天然或变性条件下目的蛋白的纯化 ? 批次小量纯化或柱层析纯化方法 ? 纯化真核表达体系来源的 His·Tag 融合蛋白 ? His·Tag 融合标签的去除 ? 目的蛋白的结合 ? 推荐资料 默克生命科学服务热线：400 820 8872 bioteam@ 一、亲和纯化样品的前处理 1. 菌液体积-起始目的蛋白量 纯化条件的优化需考虑多个因素，包括 His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采 用一个较高的浓缩系数（concentration factor）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积 的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的 裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表 1。 例如，某蛋白表达水平约为 0.1mg/ml，需要在变性条件下进行小批提纯，则 100ml 的培养物离心获得的菌体， 按浓缩 100 倍比例重悬于含变性剂的 1ml 裂解/结合缓冲液中。 在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用 50-100 倍浓缩。 表 1 确定所需菌液体积 His·Tag 融合蛋白浓度 表达水平 变性条件 培养体积 His·Tag 融合 蛋白总量 浓缩系数 （ 在 1ml 溶液中裂解后） 50mg/L 40% 3ml 150g 3× 10mg/L 8% 10ml 100g 10× 2mg/ L 1.6% 25ml 50g 25× 0.5mg/ L 0.4% 50ml 25g 50× 0.1mg/ L 0.8% 100ml 10g 100× 天然条件 1mg/ L 1% 50ml 50g 50× 1mg/ L 1% 100ml 100g 100× 与其它亲和纯化介质一样，His·Bind 树脂在接近其结合载量时使用，可以获得最好蛋白分离效果。所以在蛋白纯化前估计细菌 抽提物中目的蛋白的含量，有利于确定上样量、选择合适体积的亲和树脂或预装柱。SDS，Western blot，S·TagTM Rapid Assay，FRETWorksTM S·Tag Assay 等方法都可用于确定抽提物中目的蛋白的含量。 2. 细菌裂解获得可溶蛋白 ? BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法 BugBuster Master Mix（货号71456）是将BugBuster蛋白抽提试剂，Benzonase核酸酶和rLysozyme?溶菌酶溶 液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预 混形式的试剂减少了稀释试剂