脂质体包埋法和电击法.ppt

电击法与脂质体包埋法 一、哺乳动物细胞的基因导入方法 转染技术在初期时发展相当缓 慢，分子生物学技术，特别是质粒 DNA 克隆技术的进步极推动了转 染技术的进步。现在人们可以轻而 易举地大量制备高纯度的 DNA 和 RNA ，但同时要求有更高效率的 转染技术和更多的细胞种类。由此， 人们发明了电穿孔和脂质体介导的 技术。 二 . 动物细胞物理转化法 ? 磷酸钙共沉淀法 ? 电击法 ? 脂质体包埋法 ? DNA 显微注射法 电 击 法 ? 将受体细胞悬浮于含有待转化 DNA 的溶液中，在盛有上述悬浮 液的电击池两端施加短暂的脉冲 电场，使细胞膜产生细小的空洞 并增加其通透性，此时外源 DNA 片段便能直接进入细胞质。 ? 电穿孔转化法操作简单，而且几 乎对所有含细胞壁结构的受体细 胞均有效，但转化效率差别很大 。 电穿孔法转染哺乳动物细胞 ? ①转染前按照实验设计取出欲转染的 DNA(1 － 20μg 用于稳 定转染，瞬时转架可观用到 10- 40μg) ，用乙醇沉淀法进行浓 缩并灭菌，临转染前在洁净工作台内将 DNA 溶解在 10μl TE 中 ? ②培养细胞至 50 ％－ 75 ％汇合， 4 ℃ 下 640g 离心 5 min ，收 获细胞，若为贴壁细胞，可用胰蛋白酶消化并用血清将胰蛋 白酶灭活 ? ③用原培养基 1 ／ 2 体积的冰浴预冷电穿孔 缓冲液重悬细胞， 4 ℃ 640g 离心 5min ，弃 上清 ? ④用冰浴预冷电穿孔液重悬细胞 ,1 × 107 个 细胞／ ml ，用于稳定转染， 8 × 107 四个细 胞／ ml 用于瞬时转染 ? ⑧电穿孔杯置于冰上 10min ? ⑨用 20 倍体积的非选择性完全培养基稀释转 染细胞并淋洗电穿孔杯以移去所有转染细胞 ? ⑩稳定转染实验在非选择性培养基中培养 48h （约两代）后更换选择培养基，瞬时转 染则在转染 48 － 72 h 后收获细胞，进行表 达水平检测。 ? ⑤在每个电穿孔专用细胞小室（ Cuvette ）中加人 0.5ml 细胞悬 浮 液并置于冰上 ? ⑥加人欲转染 DNA ，手指轻弹混匀，冰上放置 5 min ? ⑦将电穿孔杯置于电穿孔仪内，在优选的条件下电击一次或多次 。电压、电容及电击次数因细胞不同而异，应进行优选。一般电 压为 250-750V ／ cm ，电容为 25μF ，脉冲时间为 20-100 ms Multiporator 多功能细胞电穿孔 / 融合仪 Multiporator 多功能细胞电穿孔 / 融合仪 脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双 分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是 运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能 ，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用 作外源物质进入细胞的载体。 阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸 的磷酸根通过静电作用将 DNA 分子包裹人内， 形成 DNA 一脂复合体，也能被表面带负电荷的 细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞 作用，偶尔也通过直接渗透作用，将 DNA 传递 进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体 其中一 小部分 DNA 能从包涵体内释放，并进入细胞质 中，再进一步进入核内转录、表达。 脂质体 包埋法 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和 病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙 法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法 使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法 使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大 ；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响； 所以现在对于很 多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。 利用脂质体转染法最重要的就是 防止其毒性 ，因此脂质体与质粒的比 例，细胞密度以及转染的时间长短和 培养基中血清的含量都是影响转染效 率的重要问题，通过实验摸索的合适 转染条件对于效率的提高有巨大的作 用。