qPCR 样本处理(1)--------人外周血淋巴细胞RNA的提取方法.docVIP

人外周血淋巴细胞RNA的提取方法 一、采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般为1ml；一般地，1ml外周血中含有大约1-2*10^6个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。 二、提取淋巴细胞。取1.5ml?无菌无酶的离心管，为管1，先加入500ul淋巴细胞分离液；另一个1.5ml?无菌无酶的离心管中，装有500ul血样的真空管和500ul PBS（磷酸盐缓冲液），1：1混匀的混合物，共1ml。然后缓慢把混匀的血样PBS混合液加入到有淋巴细胞分离液的管1中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。1500rpm,15min,20摄氏度。 说明： 1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过4小时。实验过程中一直保持室温条件，一般20摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温37摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。 2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置4℃保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室 温时，摇匀后使用； 整个分离过程中，温度应控制在18-28℃且在无菌环境下，