mll-空肠弯曲菌实验室检测及研究新进展(2016).ppt

抑制其它细菌生长剂 以抗生素为主，包括： 杆菌肽 多粘菌素 新生霉素 放线菌酮 头孢唑啉 万古霉素 三甲氧苄氨嘧啶(TMP) 两性霉素B 等 添加剂 5-10%脱纤维羊血 7%溶解马血 8%鸡卵黄液 0.4％活性碳 0.025％硫酸亚铁 0.025％丙酮酸钠 0.01％去氧胆酸钠 0.01％甘氨酸 等等 Karmali选择性培养基 初次分离培养如果使用Karmali选择性培养基，建议不加血 纯化细菌时可以推荐使用Karmali加血培养基，同样培养条件下，前者菌落更湿润，菌苔较大 2、培养方法 （1）直接划线：用无菌棉签蘸取约黄豆大小的新鲜粪便，转移到选择培养基上，用接种环三区划线；水样便或粘液样便可用移液器直接吸取100ul接种平皿 忌用无菌棉签直接划线 （2）直接过滤：将黄豆大小的新鲜粪便溶于500ul～1ml生理盐水，用移液器吸取100ul ～ 200ul液体分散于滤膜上，接种好的平皿微需氧环境放置40min到1h之间,移去滤膜，置于微需氧环境中培养。 1.根据滤膜大小可适当增加加样量 2.若标本为粘液便或水样便可用移液器直接向滤膜上加样 3.过滤时平皿要置于微需氧环境，过滤时间控制好 建议 腹泻粪便中感染菌量较少（103CFU/g粪便）直接划线培养和直接过滤没有显著差异，但都优于增菌培养，粪便中菌量较多（106CFU/g粪便）建议采用直接划线法； 微孔滤膜直径：0.45-0.65μl 革兰染色可以从选择性平板挑菌落 * 分离培养 一般mCCDA作为第一选择性分离培养基； 第二选择性分离培养基最好选用分离原理与mCCDA 不同的选择性培养基，增加空弯分离几率； 选择一个不加头孢哌酮的选择性培养基，如Preston平板 或加血的Skirrow等。 分离培养 所用培养基：Skirrow和mCCDA Skirrow：基础培养基+抗生素+FBP溶液+羊血 抗生素：万古霉素、多粘菌素B、三甲氧苄氨嘧啶 42 ℃ FBP：丙酮酸钠、焦亚硫酸钠、硫酸亚铁 1.新鲜配制，避光保存，滤膜过滤。 2.修复细胞损伤成分，中合培养基中氧及其它代谢 产物对细菌的毒作用 羊血：冻融，5% 分离培养 所用培养基：Skirrow和mCCDA mCCDA：基础培养基+抗生素 抗生素：头孢哌酮、两性霉素B 不加羊血 倒平板时候要摇匀 分离培养 培养条件： 微需氧培养：5% O2、10% CO2、85% N2 培养温度：42 ℃ 培养时间：24h ～48h 增菌液接种 将Skirrow或mCCD琼脂平板在42 ℃±1 ℃烘干表面水分，将0.45μm～0.6μm无菌滤膜轻轻贴在平板的中间，不要产生空隙；取24 h增菌液200μL ～ 250μL滴加在滤膜上，室温静置45 min ～ 60min，待液体全部透过滤膜后，用无菌镊子将滤膜轻轻揭下，弃去，翻转平板，微需氧条件下42 ℃±1 ℃培养48 h± 2 h。 分离培养 空弯在mCCDA和Skirrow上生长的菌落特点： 沿划线生长的水滴样，灰白色，培养时间长后会有金属光泽。 分离培养 样品：鸡腿； 增菌：Bolton肉汤 分离平板：Skirrow 纯化 所用培养基：哥伦比亚血平板 基础培养基 羊血：新鲜羊血 弯曲菌属鉴定 可疑菌落 革兰染色 动力试验 氧化酶试验 微需氧25 ℃生长试验 有氧42℃ 生长试验 结果相符合者，确定为弯曲菌属 弯曲菌属鉴定 其它方法： 乳胶凝集试验 O.B.I.S弯曲菌检测试剂盒 空肠弯曲菌鉴定 弯曲菌属 过氧化氢酶试验 马尿酸钠水解试验 吲哚乙酸酯水解试验 头孢菌素敏感试验 萘啶酮酸敏感试验 结果相符合者，确定为空肠弯曲菌 马尿酸水解试验 混匀 37度孵育2小时 加入茚三酮孵育10分钟后结果 空肠弯曲菌鉴定 API Campy 生化试剂条： 菌悬液的浓度：6麦氏浓度 培养温度：36 ℃ 培养条件：需氧、微需氧 关注生化孔：HIP、EST 空肠弯曲菌鉴定 API Campy 结果判读： 空肠弯曲菌鉴定 其它方法： PCR 模板DNA的制 无菌接种环挑取少量菌苔，在 200 μL无菌超纯水中混匀（菌悬液呈肉眼可见的微混浊状即可，不宜过度混浊），于100 ℃水浴中加热 10 min 后，13 000×g离心2 min，上清液即为制备好的DNA模板，将其转于另一无菌离心管中备用。 四种弯曲菌特征基因序列和PCR片段大小 检测基因 引物序列 片段大小（bp） 23S rRNA (弯曲菌) 23S-F: 5’-TATACCGGTAAGGAGTGCTGGAG-3’ 650 23S-R: 5’-ATCAATTAACCTTCGAGCACCG-3’ hip