第十章生物技术.pptVIP

2. 无菌苗制备 3. 外植体与农杆菌共培养 取 7d 左右的棉花无菌苗置于无菌平皿，迅速切成 0.5-0.7cm 左右 的小段，放入农杆菌工程菌液，放置 5-10min ；期间摇动三角瓶 数次，然后取出下胚轴小段，置于干燥的无菌滤纸上，吸干材 料表面的菌液， 吹 5 分钟使表面稍为干燥，分散布于垫有滤纸的 共培养培养基 (MS 无机盐 +B 5 有机物 +2,4-D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l+ 葡萄糖 30g/l + 琼脂 7.5g/l, pH 5.6 ) 中， 19-21 ℃ , 暗 培养 48 小时结束共培养。 4. 将共培养后的材料接入筛选培养基（ MS 无机盐 +B 5 有机物 +2,4- D 0.1mg/l+ KT0.1mg/l+ 葡萄糖 30g/l + 琼脂 7.5g/l+ 卡那霉素 50mg/l+ 头孢霉素 200mg/l , pH 5.6 ) 中 ，28℃暗培养，每三周继 代一次 5. 将筛选培养基的抗性愈伤组织接入胚状体诱导培养基，28℃光 照培养。把诱导产生的胚状体接入胚状体萌发培养基长芽；再进 一步置于生根培养基生成完整的转基因植株。 6. 将根系健壮的植株移入盆钵，凉棚过渡 3 ～ 5d ；然后移到自然条 件下生长，直至成熟。 （三）农杆菌转化水稻的 愈伤组织 ? 1. 农杆菌的活化：超低温冰箱内取出保存菌株的甘油管在 冰上融化， YEP 平皿上划线， 28 ℃暗培养 36-48hr ，待皿 内长出清晰的单菌落，接种于含卡那霉素和利福平的 LB 培养基中， 28 ℃摇菌 6-8hr 至 OD=0.5 ，再将要好的菌以 1:1000 的比例接种到 ABC 培养基中，过夜摇菌，取摇好 的菌液 30ml ，离心收集菌液，用 AAM 培养基重悬， OD 值 =0.4 之间即可用于侵染。 2. 农杆菌与水稻愈伤组织共培养 : 取预培养 15d 的质地均匀健康的胚性愈 伤组织接入 100ml 锥形瓶，加入农杆菌菌液，浸泡 30min ，倒去菌液，用 灭菌滤纸上吸干表面菌液，接入共培养培养基25 ℃，暗培养 2 — 3D 3. 抗性愈伤的选择与培养：将共培养后的愈伤组织用无菌水清洗 5 — 6 次， 再加入灭菌水（含 1000mg/l 头孢霉素）在 25 ℃， 120r/min 下摇动 3h ， 倒灭菌水，将愈伤组织置于灭菌滤纸上吸干，接入筛选培养基（ 2mg/l 500mg/l 头孢霉素、 200mg/l 氨苄青霉素、 50mg/l 潮霉素），25℃弱光培 养 20 天左右。 4. 植株再生与移栽：将筛选培养基的抗性愈伤组织接入分化培养基，直 至分化成苗，根系好的再生植株直接移栽，发育不良的可以嫁接移栽 。 八、农杆菌介导的遗传转化具有以下特点 优点： ? 操作简便 ? 转化效率高 ? 转化机理明确 ? 外源基因多以低拷贝插入、遗传稳定。 缺点： ? 转化周期长导致体细胞无性系变异严重 ? 基因型依赖性强 ? 需要深厚的组织培养基础 第三节 基因枪法 基因枪法（ gene gun) 又称离子枪法、 微弹轰击法、生物炸弹法 一、基因枪转化的基本原理 将外源 DNA 包被在微小的金粒或钨粒表面， 然后在高压的作用下微粒被高速射入受体 细胞或组织。微粒上的外源 DNA 进入细胞后 ，整合到植物染色体上，得到表达，从而 实现基因的转化 二、基因枪转化的优点 ? 无宿主限制： 基因枪技术没有物种限制，对双子叶和 单子叶植物都可适用，对动物、微生物也同样适用。 ? 靶受体类型广泛： 几乎所有具有潜在分生能力的组织 或细胞都可以用作基因枪转化的受体。 ? 操作简便快速，转化周期短 ? 转化频率低 ? 嵌合体较多 ? 结果的重复性差 ? 转化的外源基因以多拷贝居多易导致基因沉默 ? 遗传稳定性差 ? 实验成本较高 ? 外源 DNA 的整合机理等理论问题不清楚 三、基因枪转化的缺点 四、基因枪转化的操作方法 小麦的幼胚基因枪转化 1. 无菌材料的获得和培养 取大田小麦开花后 14--18 ｄ的麦穗，剥出幼嫩种子，用 0.1 ％升汞灭 菌 10min ，于超净工作台上挑出幼胚，盾片朝上接种于诱导培养基 MS2 （ MS ＋ 2,4D mg/l ＋ ABA0.5 mg/l ＋水解乳蛋白 500 mg/l ＋蔗糖 3% ）上， 25 ℃ ，暗培养。１４ｄ后将产生的淡黄色新鲜愈伤组织在转化前 4--6 ｈ进行渗 透处理，渗透培养基为 MS2+0.2 mg/l 甘露醇＋ 0.2 mg/l 山