中国药科大学生化设计性实验报告参考菠萝蛋白酶的提取和活力测定.pptVIP

项目一 从菠萝中提取菠萝蛋白酶 微生物 09301 班第三实验小组 成员：徐雨婷 杨洋 刘杨 何威 刘鄂龙 一、实验目的 1 、掌握从原料物中提取分离目的蛋白酶； 2 、掌握对目的蛋白酶质量的检验； 3 、学习酶比活力的计算； 二、实验基本原理 菠萝蛋白酶是一种具有消炎，抗水肿作用的疏基酶， 能分解蛋白质、酯和酞胺。 菠萝蛋白酶一般从菠萝汁或菠萝废皮中提取，为浅黄 色无定形粉末，分子量 33000 ，微有异臭，微溶于水，不 溶于乙醇、丙酮、氯仿，乙醚，等电点 9.55 。 本实验先从新鲜的菠萝汁中使用有机酸（单宁）沉淀 法提取出菠萝蛋白酶，然后通过考马斯亮蓝法测定酶制品 中菠萝蛋白酶的总量，最后菠萝蛋白酶将酪蛋白水解产生 酪氨酸，通过在 275nm 波长下测定吸光度的变化，可以测 得菠萝蛋白酶的活力。 三、实验材料和试剂 1 、实验材料 新鲜菠萝 (0.735kg) 、 0.1mg/ml 牛血清蛋白 2 、实验试剂 ? 柠檬酸钠 ? 维生素 c ? 单宁 ? 0.1íTA 溶液 ? 1.5% 氯化钠溶液 ? 1% 酪蛋白溶液 ? 1mol/L 氢氧化 钠溶液 ? 0.05mol/L 磷酸缓冲液（溶解磷酸二氢钾，加氢氧化钾调 PH 至 7.0 ） ? 激活剂（ PH7.0 ， 0.05mol/L 磷酸缓冲液，内含 15mmol/L 硫代硫酸钠和 6mmol/LEDTA-2Na, 现配现用 ） 四、实验器材和仪器 1 、榨汁机； 2 、离心机； 3 、紫外可见分光光度计（ 1cm 石英比色皿）； 4 、恒温水浴锅（ 37 ℃）； 5 、试管、试管架； 6 、烧杯、容量瓶； 7 、移液管； 五、实验操作方法法和步 骤 （ 一）从菠萝中提取菠萝蛋白酶 操作步骤： 将菠萝切碎 加柠檬酸钠，榨汁 菠萝汁 纱布过滤 澄清液 2000r/min ， 7min 离心 上清液 沉淀物 酶复合物 酶复合物沉淀 加 Vc,0.2% 单宁溶液 搅拌 15min, 静置 40min 4200r/min,5min 离心 加 100ml0.1íTA 溶液， 200ml1.5% 氯化钠液 4200r/min,5min 离心 加 适 量 1.5% 氯 化 钠 溶 液 ， 4000r/min,7min 离 心 冻存备用 （ 二）考马斯亮蓝法测定酶制品中蛋白酶含量 1 、标准曲线的制作 按下表操作 试管号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准蛋白 （ 0.1mg/ml) 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 待测酶蛋白 (ml) 0 0 0 0 0 0 0 1.0 磷酸缓冲液 (ml) 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 考马斯亮蓝 (ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 吸光度 A 0 0.115 0.148 0.245 0.395 0.525 0.582 0.140 （稀释 5 倍） 根据上表，以吸光度为纵坐标，标准蛋白质量为横坐标作图 根据线性拟合关系 y=6.2357x, 计算蛋白酶的质量 （ 三）菠萝蛋白酶活力的测定 1 、取酶制品溶解于 0.05mol/L 磷酸缓冲液（ PH7.0) 至 10ml, 离心得上清液； 2 、取 5 支试管，分别标号 1 、 2 、 3 、 4 、 5 ，各加 1ml 溶液酶 和 0.9m 激活剂； 3 、另取 5 支试管，分别对应标号 ? 、 ? 、 ? 、 ? 、 ? ，各加 1ml 缓冲液和 0.9ml 激活剂； 4 、将 10 支试管置于 37 ℃水浴； 5 、然后按下表操作 试管号 1 2 3 4 5 ? ? ? ? ? 1% 酪蛋白 （ ml) 0.2 0.4 0.6 0.7 0.8 6 、按步骤 5 混匀，在 37 ℃水浴下反应 10 min; 7 、向 10 支试管中各加入 8ml1mol/L 的氢氧化钠溶液，摇匀， 于室温放置 30min; 8 、取各自对应的试管在 275nm 波长下测定吸光度 9 、测定结果如下