包涵体蛋白质复性 纯化.pptVIP

大 肠 杆菌 包涵体表 达 (His) 6 融 合蛋白的 扩 增， 纯 化和 复 性 E.g2: Market Proportion by Host Cells (biopharmaceutical proteins or ”Pharmateins” ) Yeast: 28% E. coli : 54% Animal cell : 21% E. coli inclusion body route occupies about a half 包涵体 ： 在某些生长条件下，基因工程菌能 积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚 在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构， 这种水不溶性的结构称为包涵体（ Inclusion B odies ， IB ）。 包涵体的组成及特性 一般含有 50% 以上的重组蛋白，其余为核 糖体元件、 RNA 聚合酶、外膜蛋白等，环状或 缺口的质粒 DNA ，以及脂体、脂多糖等，大小 为 0.5-1um ，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、 盐酸胍等。 包涵体与蛋白种类及表达系统无关，仅为 蛋白过量表达的结果 。 包涵体的形成 在重组蛋白的表达过程中缺乏某些 蛋白 质折叠的辅助因子 ，或环境不适，无法形成 正确的次级键等原因形成的。 最大缺点：一级结构正确，高级结构错误。 包涵体形成的主要原因 1. 表达量过高。原因可能是合成速度太快，以至于 没有足够的时间进行折叠，二硫键不能完全正确的配对， 过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的 溶解度等。 2. 重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多 越易形成包涵体 3. 重组蛋白所处的环境：发酵温度高（ 37-42 ℃）或 胞内 pH 接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4. 重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生 物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易 形成包涵体沉淀。采用共表达分子伴侣的方法以增加可 溶蛋白的比例。 包涵体表达的有利因素 Advantages: 1. 可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体 表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。 2. 降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的 30% 3. 包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心 就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化。 4. 包涵体表达的蛋白质没有活性，细胞破碎和以后复性 前的纯化步骤，不用考虑蛋白质的失活问题 。 1. 对表达蛋白的胞内修饰过程不了解。 2. 要求复杂和精确的复性过程 3. 复性过程的收率往往很低，经常成为放大的 瓶颈 包涵体表达的不利因素 Disadvantages: 分离纯化细菌包涵体蛋白质的 基本步骤 ： 破碎细胞 ( Disruption of cell ) ↓ 分离包涵体 (Seperation of inclusion body) ↓ 溶解包涵体 (Dissolve inclusion body) ↓ 蛋白质产物的构象复原等。 (Recovery of target protein conformation) 包涵体的复性前准备 洗涤 ： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋 白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前 要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如 2M 尿素在 50mM Tris pH7.0-8.5 左右、 1mMEDTA 中洗涤。此外可以用温和去垢剂 TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜蛋白。 包涵体的溶解 1. 采用高浓度的 变性剂 ，使其形成伸展的 肽链。常用的变性剂有尿素（ 8M ）、盐酸胍 （ GdnHCl 6-8M ），通过离子间的相互作用， 破坏包涵体蛋白间的氢键而增