培养基的配制与灭菌.pptVIP

. 2、常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类： 物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。 化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。 这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 1、培养基用湿热灭菌：培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。 常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到0.05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。关阀再通电后，压力表上升达到0.1MPa时，开始计时，维持压力0.1～0.15MPa 20分钟。 对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。 对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20～30min。 高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2～0.3 单位。 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。 在8％～20％蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15％～25％的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基pH值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1％活性碳时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1％活性碳，蔗糖水解率可达5％。 为防止高压灭菌产生的上述一些变化可用下列方法： (1) 经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料，以便及时采取有效措施。 (2) 设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量(在0.1％以下)注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。 (3) 配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在最后加入。 (4) 注意高压灭菌后培养基pH的变化及回复动态。如高压灭菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。 2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌 3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌 4、不耐热的物质采用过滤灭菌 5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌 . . 第三章 培养基的配制及灭菌 一、培养基及其作用：是向植物细胞提供营养的场所。其作用是向植物细胞提供所需的各种营养；调节渗透压、酸碱度；供给水分。固体培养基还起着支撑作用。 培养基多以命名人的名字命名。目前，比较流行的培养基有： MS培养基，其特点是无机盐和离子浓度较高； B5培养基，其特点是含有较低的铵； White培养基，其特点是无机盐低，适于生根； N6培养基，其特点是KNO3和(NH4)2SO4含量较高，适于花药培养； KM－8P培养基，其特点是有机成分较多，适于原生质体培养。 二、培养基的成分：主要可以分水、 无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。 1、水：植物原生质体的组成成分，代谢过程的介质和溶媒。 大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，防止贮藏过程发霉变质。 ２、无机元素：大量元素，指浓度大于0.5mmol/l的元素，有N、P、K、Ca、Mg、S等。其作用是： (1) 氮：是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分。供应的氮化物有硝酸铵、硫酸铵、硝酸钾等。有时，也添加氨基酸来补充氮素。 (2) 磷：是生物膜、核苷酸（ 如ATP）、核酸的重要组成部分。常用于培养基的磷化物有ＫH2PO4或ＮaH2PO4等。 (3) 钾：Ｋ对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。制备培养基时，常以KCl、KNO3等盐类提供。 (4) Mg、S和Ca： Mg是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂； S是含S蛋白质的组成成分。它们常以MgSO4·7H2O提供。 Ca是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用，常以CaCl2·2H2O提供。 (5) 微量元素：指小于0.5mmol/l的元素，Fe、B、Mn、Cu、Mo、Co等。 Fe是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分。在制做培养基时常用FeSO4·7H2O和Ｎa2-EDTA结合成螯合物使用。 B、Mn、Zn、Cu、Mo、Co等，也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长，分裂异常。 这些整株植物生长所必需的营养元素，对于植物组织培养来说也是必需的。