流式细胞术的基本原理和应用.pptVIP

流式细胞术基本原理及应用 漆冬梅 流式细胞仪（flow cytometer） 是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、 电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 台式机、临床型 大型机、科研型 目前最新型流式仪 流式细胞术（flow cytometry） 利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。 流动室与液流系统 光源与光学系统 信号收集与信号转换系统 计算机与分析系统 分选系统 流式细胞仪基本结构 流式细胞仪的液流系统 激光器 流动室 检测点 流式细胞仪的光学系统 光电转换器件 流式细胞仪的光信号 1. 散色光信号 前向角散色（Forward Scatter，FSC） 小角散色，与细胞直径成近似直线关系。 侧向角散色（Side Scatter， SSC） 90°散色，与细胞内颗粒结构的质量成近似直线关系。 物理属性：用来区分不 同细胞群体的基本形态 上的差异 利用FSC/SSC可将混合细胞分群 R1 粒细胞群 R2 淋巴细胞群 R3 单核细胞群 R4 红细胞裂解碎片和少 量血小板 图注：为外周血白细胞分群情况。由于淋巴细胞体积较小，细胞内颗粒较少，故其分布处于FSC、SSC都较小的区域，即R2区；粒细胞体积较大，细胞内颗粒较多，故其分布处于FSC、SSC最大的区域，即R1区；单核细胞体积较大，细胞内颗粒较粒细胞少，淋巴细胞多，故其分布于二者之间。 2. 荧光信号 荧光素与特异抗体结合 荧光素吸收激光能量，发生能量跃迁，产生荧光 荧光信号被特定波长的光学元件传递到信号收集器中（PMT），形成信号脉冲。 每种颜色的荧光占用一个特定波长的检测器，即荧光通道。 化学属性 荧光标记抗体与细胞结合原理模式图 常用抗体标记荧光染料的特性及其应用 荧光染料 激发波长/nm 发射波长/nm 颜色 FITC 488 525 绿色 PE 488 575 橙黄色 PerCP 488 677 深红色 APC 633 660 红色 BD LSR Ⅱ 四种激光器355nm 405nm 488nm 633nm 可进行多达10色以上的多色荧光分析 流式细胞术的应用 细胞表面分子 细胞内或细胞核内抗原 细胞凋亡 DNA含量检测与细胞周期的分析 细胞增殖 细胞毒的检测与分析 可溶性蛋白分子 报告基因 其它 样品处理 全血直接标记法 溶血：红细胞裂解液 膜表面抗原染色：孵育温度、时间、对照 固定与透膜：固定剂、透膜剂 细胞内抗原染色：透膜 上机检测：加入PBS 200-500μl，上机检测。如不能及时上机检测，则加入0.5ml 1%多聚甲醛，混匀后置于4度冰箱内保存后检测。(24h内) 谢谢观看！ 2020