人类细胞质RNA提取、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析和应用.pptVIP

用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。水平型电泳时，凝胶板完全浸泡在电极缓冲液下1-2mm，故又称为潜水式。目前更多用的是后者，因为它制胶和加样比较方便，电泳槽简单，易于制作，又可以根据需要制备不同规格的凝胶板，节约凝胶，因而较受欢迎。 ???? 常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.5~7.8)。 需注意，缺少离子时，电流太小，DNA迁移慢；相反，高离子强度的缓冲液由于电流太大会大量产热，严重时，会造成胶熔化和DNA的变性。 电泳缓冲液一般都配制成浓的贮备液，临用时稀释到所需倍数。 ???? ???? ? 低电压下，分离效果较好。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。???? 电泳系统的温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳，只有当凝胶浓度低于0.5%时，为增加凝胶硬度，可在4℃进行电泳。??? ???? DNA分子大小对迁移率的影响：DNA迁移率与分子量对数成反比。 DNA分子构象对迁移率的影响：共价闭环DNA线状DNA开环DNA。 在基因组DNA的提取中，DNA经孵育及抽提、沉淀后以70%乙醇洗涤2次，再适量的双蒸水溶解DNA。然后在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳，以1kb DNA ladder 为参照，估计DNA溶液浓度。 ⑴ 琼脂糖在免疫扩散法中的应用。免疫扩散法就是利用琼脂糖凝胶作为扩散介质，使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。双向琼脂扩散实验中也用琼脂或琼脂糖作为扩散介质，原因同上。⑵ 琼脂糖在双链DNA探针的合成方法中的作用。双链DNA探针的合成方法主要有切口平移法和随机引物合成法。 * 选择电泳类型 用于分离核酸的琼脂糖凝胶电泳可分为垂直型及水平型（平板型）。 STEPS does matter * 选择缓冲液系统 常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L (pH7.5~7.8)。 STEPS does matter * 凝胶的制备 以稀释的电泳缓冲液为溶剂，用微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。 STEPS does matter * 样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使样品集中。 STEPS does matter * 电泳 在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。因此为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。 STEPS does matter * 染色与照相 常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。 STEPS does matter * 结果分析 （一）、影响琼脂糖凝胶电泳的因素 DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比； 琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同； DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较