小鼠肝脏RNA的提取纯化与鉴定.docx

分子生物学实验报告 一、实验时间： 2011年11月21日 10:00—17:30 二、实验内容： 小鼠肝脏RNA的提取纯化与鉴定 三、实验目的： 了解总RNA提取的基本原理、应用及操作的注意事项，熟悉掌握组织中总RNA提取方法及其检测方法。 四、实验原理： 在真核生物，由于绝大多数基因含有内含子，因此不能直接由基因组克隆目的基因，提取RNA并逆转录形成cDNA或构建cDNA文库是获取真核生物表达基因的主要手段，此外，在利用Northern印迹杂交等技术分析基因表达水平时也需要提取RNA。本实验要求自小鼠肝脏提取RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳进行检测，通过紫外分光光度法进行定量。 RNA是极易降解的核酸分子，这主要是因为RNA酶分布广、活性强、且难以失活，痕量的RNA酶就能够造成严重的RNA降解。抑制RNA酶活性的方法很多，但均不能彻底避免RNA酶对RNA的降解。 焦磷酸二乙酯（DEPC）是一种强烈的烷化剂，它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制RNA酶的活性。DEPC是消除外源性RNA酶的主要方法。以0.1%DEPC处理实验器皿与试剂配制用水，基本可以消除外源RNA酶的污染。但DEPC具有致癌性，在使用时一定要留意。DEPC处理的器皿与水必须经高压灭菌处理，使DEPC分解后方能使用。值得注意的是，DEPC具有很强的反应性，能够与包括RNA在内的多种生物分子以及多种化学试剂作用，因此不能直接用于抑制样品以及试剂中的RNA酶活性。 在RNA抽提试剂中加入异硫氰酸胍，是抑制样品来源RNA酶活性的主要方法。作为一种蛋白变性剂，异硫氰酸胍可导致包括RNA酶在内的所有酶活性的丧失，因此RNA纯化过程中因尽可能去除异硫氰酸胍，以防止其对酶促反应的影响。在使用蛋白质变性剂的同时，更重要的是去除样品中的蛋白质，防止内源性RNA酶对样品RNA的降解。 逆转录反应时，反应体系中不能含有烷化剂或变性剂，此时痕量的RNA酶也可能对RNA产生破坏。在这种情况下，最适宜的方法是加入特异性的RNA酶抑制剂。这类RNA酶抑制剂本身是蛋白质，可专一性作用于RNA酶，对RNA的逆转录以及体外翻译等过程均无干扰。 抽提RNA的关键在于去除DNA与蛋白质，最常用的方法是酸性酚法。苯酚在酸性条件下可溶解DNA而不溶解RNA，同时酚又是蛋白变性剂。利用酸性酚试剂与氯仿的抽提，可一步完成细胞的裂解以及蛋白质与RNA的分离。最后利用异丙醇沉淀，即可获得纯化的总RNA。 RNA产物的定量与纯度检测一般是通过紫外分光光度法。高纯度的RNA其A260/A280应处于1.6至1.8之间，A260与RNA浓度呈正相关。RNA的完整性可通过电泳检测。由于RNA为单链分子，二级结构复杂，必须首先利用甲醛胺变性RNA，再进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳。细胞总RNA包含了三种主要组分，其中rRNA含量最高，因此在电泳时可观察到18S和28S rRNA的条带。如两条条带清晰，且亮度之比接近1:2，则表明RNA没有发生降解。一般情况下泳道前缘还可观察到一条较为模糊且亮度较弱的条带，主要由5S、5.8S rRNA与tRNA 组成。如果RNA严重降解，则此条带亮度会明显增强，mRNA由于含量较少且长度不均一，一般观察不到相应的条带。 本实验的要求是采用酸性酚法自小鼠肝组织抽提RNA，通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，即经电泳因观察到18S与28S rRNA的清晰条带，最后通过紫外分光光度法对RNA进行定量与纯度检验，计算RNA产物的浓度与含量。 五、主要实验试剂与仪器： 1、Tissue Ruptor，购自QIAGEN。 2、塑料器皿，应用0.1%DEPC浸泡12h，121℃高压灭菌15min，干燥即可使用。 3、无RNA酶水：用去离子水配制0.1%的DEPC，购自SAGON，37℃保温12h，121℃高压灭菌15min。 4、Trizol试剂：酸性酚试剂，购自Takara公司。 5、氯仿 6、异丙醇 7、75%乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。 8、5×甲醛变性电泳缓冲液：MOPS 0.1M（pH 7.0），乙酸钠 40mM，EDTA 5mM（pH8.0）。 9、RNA电泳用加样缓冲液：50%甘油，1mM EDTA（pH8.0），0.25%溴酚蓝。 六、实验方法与步骤： （一） RNA的抽提 1. 引颈处死小鼠，迅速取出肝组织约50~100mg于匀浆管，加入Trizol 试剂1ml，充分匀浆，室温放置10分钟。 2. 12000rpm离心10min，取上清。 3. 加入氯仿0.2ml,剧烈震荡15s,4℃放置10min,12000rpm离心15min,取上清。氯仿的主要作用是将酚从溶液中萃取出来。离心后溶液分为三相，即上层的水相，下层的有机相以及