猪流行性腹泻诊断技术.docVIP

Ｎ Ｔ　 ４ ０ ２ Ｙ／ ５ －２ ０ ４ ６ ２ 操作方法 ． ６２ ．门 冲洗包被板 向各孔注人无离子水， 　　　　 浸泡 ３　ｎ 甩干， ｍｉ， 重复 ３ ， 次 甩干孔 内残液， 在滤纸上吸干。 ６ ２ ２ 抗原包被 ．． 用包被稀释液稀释抗原至使用浓度， 　　　　 包被量为每孔 １０　 ， ４ ０｝ 置 ＇ ， Ｌ Ｃ冰箱湿盒内过夜， 弃掉包被液， 用 洗液冲洗 ３ 每次 ３　 ． 次， ｍｎ ｉ ６２ ３ 加被检及对照血清 ．． 将每份被检血清样品用血清稀释液做 １ １０ 　　　　 ：０ 稀释， 加入两个孔， １０　。 每孔 ０ ｐ 每块反应板设阳性、 Ｌ 阴性血清及稀释液对照各两孔， １０　 每孔 ０ ｐ Ｌ盖好包被板置 ３０湿盒内１ ， ７　 Ｃ ｈ冲洗同 ６２２　 ．　ｅ ．　 ６２４ 加酶标抗体 ．　 ． 用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释至使用浓度， 　　　　 每孔加 １０　， ３ Ｃ ０ ｔ 置 ７　 ｝ Ｌ 湿盒内１ ， ｈ 冲洗同６２２ ．．０ ６２ ５ 加底物溶液 －． 每孔加新配制的底物溶液 １０　 　　　　 ０ｐ Ｌ在室温下避光反应 ５　 －１ ｍｎ ｍｎ ０　 ． ｉ ｉ ６ ２ ６ 终止反应 ．． 每孔加终止剂５ ｒ ． 　　　　 ０　 ｝ Ｌ ６ ３ 结果判定 ． ６ ３ １ 目测法 ． ．　 阳性对照血清孔呈鲜明的桔黄色， 　　　　 阴性对照血清孔无色或基本无色， 被检血清孔凡显色者即判抗体 阳性 。 ６ ３ ２ 比色法 ．　 ．　 用酶标测试仪， 　　　　 在波长 ４２　 ９ｎ ｍ下， 测定各孔Ｏ Ｄ值， 阳性对照血清的两孔平均Ｏ Ｄ值＞。６阴性对 ．， 照血清的两孔平均Ｏ Ｄ值（０１２ ．　 为正常反应， Ｄ值）０２０ ６ Ｏ ．　 为阳性； Ｄ值 。２０ ．　 时判为 ０ Ｏ ．　－０４０ ０ ０ “ ； ４０ －．　 判为“ 十’０ ０－０８。 ．　 ０ ＋＋＂Ｏ ； Ｄ值＞０８０ ．０ 判为“ ＋十＋＇ Ｄ值在 ０１３ ０２０ ；　 Ｏ ．　￣　 ０ 之间为疑似； ６ ．　 ０〕 １值＜０１３ 一”对疑似样品可复检一次， ．　为“ ， ６ 复检结果如仍为疑似范围， 则看Ｐ Ｎ比值，／ 比 ／ ＰＮ 值 ）２ 判为阳性， ／ 比值＜２ ＰＮ 者判为阴性。 Ｎ Ｔ　 ４ ０ ２ Ｙ／ ５ －２ ０ ４ 附 　　 录 Ａ （ 规范性附录） 溶 液 的 配 制 Ａ １　．　 ｏ／ ｐ ７２ － ００ ｍ ｌ Ｈ ．　 　 ２　 Ｌ　 磷酸盐缓冲液（Ｂ ） Ｐ Ｓ 的配制 Ａ ，飞 ０２　ｌ ．． ．　ｏ Ｌ磷酸氢二钠溶液： ｍ ／ 称取磷酸氢二钠（ ａ Ｐ ， １Ｈ０ ７－４　 Ｎ ， Ｏ ? ２ ， ）１６ ｇ先加适量无离子水 Ｈ ， 溶解， 最后定容至 １ 。 ｍ ， 。。 Ｌ 混匀。 Ａ １２　．　ｏ Ｌ磷酸二氢钠溶液： ．． ０２　ｌ ｍ ／ 称取磷酸二氢钠（ ａ ｉＯ ? Ｈ０ ３．１　 Ｎ ＨＰ ， ２ ，）１２ ｇ先加适量无离子水 ， 溶解， 最后定容至 １　 ｍ ， ００　 混匀。 ０ Ｌ Ａ １３ 量取 ０２　 ／ ．　 ．　 ．　 Ｌ Ｌ磷酸氢二钠溶液 ３０　 ，． ｍ ｌ ｍ ６ ｍ ０２　 ／ Ｌ ｏ Ｌ磷酸二氢钠溶液 １０　 ， ４ ｍ 称取抓化钠 Ｌ ３ ｇ用无离子水溶解稀释至 ５　 ｍ ，℃保存。 ８　 ， ００　 ４ ０ Ｌ Ａ ２ 细胞培养液的配制 ．　 含 １％灭活犊牛血清的 １　 营养液， １０　／ Ｌ青霉素、０ ｌ　 Ｌ链霉素， ５６ 　　　　 ０ ６０ ４ 加 ０Ｉ ｍ Ｕ １０　 ｍ ｇ ／ 用 ．％碳酸氢 钠（ ａ Ｃ ，　ｐ Ｎ Ｈ Ｏ ） Ｈ值至 ７２如需换液则血清含量为 ５０ 调 ．　 ， ００ Ａ． 病毒培养液的配制 ３ １　 培养液中加下列成分使最终浓度各达到： ６０ ４ １ ％二甲基亚枫（ ＭＳ ； Ｄ Ｏ） ５　 ｍ －１ ｐ／ Ｌ胰酶； ｐ／ Ｌ ０　 ｍ ｇ ｇ １０　／ Ｌ青霉素； ０Ｉ ｍ Ｕ １ ｐ／ ｌ ０ ｇｍ 链霉素； ０　 以５６ ．％碳酸氢钠（ ａ Ｃ ８调 ｐ Ｎ Ｈ ０ ） Ｈ至 ７２ ．． ＥＥ Ａ－ Ｈ Ｐ Ｓ液的配制 ４ 称取 ０２８　 Ｈ Ｐ Ｓ溶于 １０　 ．　 ５　 Ｅ Ｅ ３ ｇ　 ０ｍ Ｌ无离子水中， １　ｌ 用 ｍ ／ ｏ Ｌ氢氧化钠（ ａ Ｈ） Ｎ Ｏ 调整 ｐ Ｈ至 ７０ ．－ ７２过滤后置 ４ ．， ℃备用。 附 录 Ｂ 　　　　　　　　　　 （ 　　　　　　 规范性附录） 直接荧光抗体法溶液的配制 乐 １ ０１％伊文斯蓝原液的配制 ． 度 浓 陈 ２ 称取伊文斯蓝 。１　 ．　 ｇ溶于 １０　 ００ ｍ ｌ ，　７２　Ｓ中，＇保存， ０ ｍ，　 ２　 ／ ｐ ．　 ｌ ．