兰陆红_微生物.docx

PAGE 4 暑期综合实验 微生物发酵工程综合实验 生01 兰陆红 学号 2010012341 小组成员：张晨熙，牛泽华 罐长：朱濛，杨宜飞 助教:郑美 实验日期：2012年8月24日至8月27日 实验目的 掌握自控发酵罐的构造，原理和操作程序； 学习在实验室内大规模培养微生物细胞或产物的方法； 了解细菌生长曲线的特征，利用细菌悬液浑浊度简介测定细菌的生长； 学习液体种子的接种方法和注意事项和种子培养基、液体培养基的配制； 学会与他人合作以及培养小组内团结互助的精神。 二、 实验背景 HSP16.3 HSP16.3是一种来自结核杆菌M.tuberulosis的小分子质量热休克蛋白，在正常情况下仅有少量表达。当M.tuberulosis从对数期到稳定期的转变中显著表达，成为细胞内主要蛋白。HSP16.3由144个氨基酸组成，分子量为16277Da。该实验中培养的细菌是可诱导表达目的蛋白HSP16.3的重组大肠杆菌BL21（卡那霉素抗性）。 E.coli BL21 BL21是常用的表达菌株，一般配合以强表达载体来进行目的基因的强表达。BL21作为表达宿主，主要是因为它把编码噬菌体T7 RNA ploymerase的整合到BL21的染色体上，当目的基因连接在含有T7启动子的表达载体上，转化到BL21中，就能实现蛋白的高表达。在T7启动子控制下，T7溶菌酶降低靶基因的背景表达但并不干扰由IPTG诱导的表达水平。 细菌的生长曲线 单细胞生物发酵具有四个阶段，即调整期，对数期，稳定期，死亡期。 调整期: 细菌从原菌培养基上接入新的培养基时，需经过几个小时的适应后，才有新的子细胞产生。在调整期的细菌 并不繁殖，只是细胞体积增大，原生质比较均匀，细胞内各种储存物逐渐消失，生理活性、代谢机能开始活跃，随着开始进行繁殖，进入对数期。 对数期：是细胞生长繁殖最旺盛的时期，所繁殖的细胞总数可以用2n来表示。对数期的长短，主要取决于菌种的本性，其次是营养物浓度和培养条件。 稳定期：细胞繁殖速度达到最高峰时，由于营养物质的消耗，代谢产物的积累，以及溶氧量，酸碱度等条件的变化，细胞总数就不再发生变化，繁殖细胞数与死亡细胞数接近平衡。 死亡期：进入平衡期，若继续培养，细胞总数不再稳定，死亡细胞数超过繁殖细胞数，细胞总数逐渐下降。 发酵工程 发酵广义上指利用微生物制造和生产各种目的的产物的过程，包括利用好氧微生物进行的好氧发酵，兼性厌氧细菌进行的兼性发酵和利用厌氧细菌进行的厌氧发酵。 发酵的基本过程包括：（1）发酵原料的预处理；（2）菌种的活化和种子扩大；（3）微生物发酵和控制；（4）发酵产物的分离提取。 发酵分为：（1）液体发酵：分批发酵；连续发酵；补料分批发酵（半连续发酵） 。我们的实验采用的是半连续发酵。（2）固体发酵：浅层发酵、转筒发酵、厚层通气发酵。 我们的实验采用的是半连续发酵。 实验仪器和药品 实验设备： 超净工作台； 恒温振荡培养箱； NBS Bioflo110fermentor, 6L发酵罐； 722S分光光度计； 300ml,500ml锥形瓶； 烧杯，5ml离心管,量筒； 实验材料 可诱导表达目的蛋白HSP16.3的重组大肠杆菌BL21（卡那霉素抗性） 种子培养基 共800ml,分8瓶装置于300ml锥形瓶中 药品 终浓度 tryptone 10g/L Yeast extraction 5g/L NaCl 10g/L 发酵培养基（4L） 将药品全部称量好后定容至3.3L。 药品 终浓度 称取量 Tryptone 10g/L 40g Yeast extraction 15g/L 60g NaCl 10g/L 40g 补料 药品 称取量 终浓度 Glucose (带一分子水) 88g 20g/L K2HPO4.3H2O 52g 10g/L NaOH 80g 5mol/L 1mol/LIPTG贮存液，过滤除菌后-20℃保存。 10%磷酸，121℃灭菌，备用； 40%氢氧化钠溶液，121℃灭菌，备用； 泡敌，121℃灭菌，备用 操作步骤 8月24日 配制培养基，121℃高压灭菌20min,在灭过菌后的LB培养液中加入过滤除菌的Km贮存液，使其终浓度为50ug/ml. 发酵培养基定容后，加入几滴泡敌，121℃高压灭菌30min；补料定容后115℃高压灭菌20min. 离心管称量 校正pH电极 （1）打开发酵罐系统的动力开关，选择“fermentation”,“screen”调至“calibration”，“enter”确认。 用“”调至“zero”。 把pH电极浸入pH值为4.01的标准缓冲液中, 调至read档后输入4.01。 用“”键调到“span”档。 pH电极用蒸馏水清洗后浸入pH为6.86的标准缓冲液中, 调至read档后输