第七章--重组DNA的转.pptVIP

1. 菌落噬菌斑原位杂交法 2. DNA序列分析法 （1）菌落噬菌斑原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。 DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列。 ACTGAAGGCT 1. 蛋白质生物功能测定法 2. 抗菌素抗性基因的鉴定 3.免疫沉淀鉴定 （1）淀粉酶目的基因的鉴定 含目的基因的目的重组子 可将其表达的淀粉酶分泌出 胞外，并均匀扩散，同时降 解淀粉为可溶性的多糖或单 糖。因此，目的重组子菌落周围会形成透明圈。 蛋白酶、脂肪酶等目的基因也可采用类似的方法进行鉴定 7.1.1 受体细胞应具备的条件 (1)限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷(2)重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） (3)具有较高的转化效率(4)具有与载体选择标记互补的表型(5)感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 1．大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定 产结构复杂、种类繁多的内毒素 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌 抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素 遗传不稳定，生长相对缓慢 主要用于抗生素生产菌株的改良 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 DNA重组操作系统欠完善 适用于真核生物基因的高效表达 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 遗传操作繁琐 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良 7.2.1细菌的转化方法 1．Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化 （1）大肠杆菌感受态细胞的制备： 100 ml菌体培养至OD600=0.5，离心收集菌体 用10 ml冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心收集菌体 用1 ml冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体 冰浴放置12-24小时，备用 取100μl感受态细胞，加入相当于50 ng载体的重组DNA连接液，混匀 冰浴放置半小时 在42℃保温2分钟（热脉冲） 快速将转化细胞转移至冰浴中放置1-2分钟 加入1 ml新鲜培养基，于37℃培养1小时（扩增） 涂在合适的固体培养基平板上进行筛选 CaCl2处理 受体细菌 50-100mmol/L CaCl2 感受态细菌 重组体转入细菌 （1）细菌原生质体的制备： 不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例： 细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液），并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。 在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂。 取0.2-1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10-20μl DNA重组连接液，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀 原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素。 1．感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基中培养至OD600=0.5 2．吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30℃保温10分钟 加入20倍体积的新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选 在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大. 1. 抗药性筛选