分子生物学的研究的方法.ppt

DNA重组的一般步骤 1.从生物有机体基因 组中,分离出带有目 的基因的DNA片段。 CNA nto fragm ants. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上,形成重组DNA分子 3.将重组DNA分子转移 O0的0(到适当的受体细胞(亦 ntrpduoc inlo bacteria to clanc 称寄主细胞)并与之 起增殖 4.从大量的细胞繁殖群 体中,筛选出获得了重 组DNA分子的受体细胞 Select clone with gene A. 并筛选出已经得到扩增 的目的基因。 重组DNA实验中常见的主要工具酶 类 能 限制性核酸内切酶 识别并在特定位点切开DNA DNA连接酶 通过磷酸二酯键把两个或多个DNA片段连 接成一个DNA分子 DMA聚合酶I(大肠杆菌)按5到方向加入新的核苷酸,补平DNA 双链中的缺口 反转录酶 按照RNA分子中的碱基序列,根据碱基互 补原则合成DNA链 多核苷酸激 把磷酸基团加到多聚核苷酸链的5’OH末 端(进行末端标记实验或用来进行DNA的 连接 末端转移酶 在双链核酸的3’末端加上多聚单核苷酸 DNA外切酶III 从DNA链的3’末端逐个切除单核苷酸 A噬菌体DN外切酶从DNA链的5末端逐个切除单核苷酸 碱性磷酸酯酶 切除位于DA链5或?末端的磷酸基团 、载体 基因工程载体是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子 进入适当宿主细胞自主复制的DNA分子。 (一)特点 1.至少有一个复制起点,因而 Hindle 至少可在一种生物体中自主 复制 2.至少应有一个克隆位点,以 供外源DNA插入 pBR322 3.至少应有一个遗传标记基因 (4.36kb) 以指示载体或重组DNA分 子是否进入宿主细胞 安全性 (二)类型 1、质粒载体 常用的克隆载体、双链环状的DNA分子(也有线 性的)、能独立地自我复制及转录。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点 ①分子量小,稳定存在,较高拷贝数; ②遗传标志; ③内切酶点。