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年产 3 吨中性淀粉酶发酵工艺设计 前言 淀粉酶属于水解酶类，是水解淀粉和糖原的酶类总称。通常通过淀粉酶 催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退 浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。此类 酶广泛存在于动、植物和微生物中，几乎所有动物、植物和微生物都含有淀粉酶。 淀粉酶是研究较多、生产最早、产量最大和应用最广泛的—类酶。特别是 20 世纪 60 年代以来由于淀粉酶在淀粉糖工业生产和食品工业中的大规模应用，它 的需要量与日俱增，到目前为止，其产量几乎占到整个酶制剂的 50 ％以上，销 售金额占到 55 ％～60 ％。按照水解淀粉的方式不向，主要的淀粉酶有α—淀粉 酶、β—淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶、环糊精葡萄糖基转移酶等。 淀粉酶已经成为工业应用中最为重要的酶之一，并且大量的微生物可以用以 高效生产淀粉酶，但是酶的大规模商业化生产仍然局限于几种特定的真菌和细菌 中。对于高效的淀粉酶的需求越来越多，这可以通过对现有酶的化学改良或者通 白质工艺改良得到。得益于现代生物技术的发展，淀粉酶在制药方面的重要性日 益凸显。当然，食品和淀粉工业仍然是主要市场，淀粉酶在这些领域的需求仍然 是最大的。 中性淀粉酶是目前使用最广泛的一种酶，主要运用于发酵、食品、医药、纺 织及造纸工业。就我国而言一般采用液态深层发酵法生产，但发酵水平低，过滤 困难，使其发展受到了较大的限制。 本课题中以枯草杆菌为实验菌株，采用液体摇瓶发酵，并在培养基中添加发 酵助剂如 Na ＋和Tween—80 等来提高酶活。 枯草芽孢杆菌可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。有 的菌株是 α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌。枯草芽孢杆菌菌体自身合 成 α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，可在消化道中与动物体 内的消化酶类一同发挥作用。枯草芽孢杆菌广泛分布在土壤及腐败的有机 物中，易在枯草浸汁中繁殖。 第 1 页 年产 3 吨中性淀粉酶发酵工艺设计 1. 菌种的选育 1.1 菌种的选育及制备 微生物是各种生物活性产物的丰富资源。在发酵前期，微生物的选择至关重 要，我们此次设计的是利用枯草芽孢杆菌发酵生产中性蛋白酶的整体过程。 选择性分离的步骤一般是： 含微生物材料采集——标本材料的预处理——菌种的分离—— 富集培养 ——菌种初选——菌种复选——性能鉴定——菌种保藏。 1.1.1 含微生物材料的选择 土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物 常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性 的土壤。 采土时先用小铲除去表土，取 5～15㎝深处的土样，选好 3～5 点，每 点取土 10g 混在一起装入灭过菌的牛皮纸袋，并记录时间、地点、植被等情况。 1.1.2 预处理 在培养过程中以淀粉作为唯一或主要碳源，控制 pH 在 6.7～7.2 。那些在所 采用的条件下最适用于淀粉代谢的微生物最终将占优势，并可在淀粉琼脂糖平板 上分离到产生中性淀粉酶的菌株。 1.1.3 所需菌种的纯化和分离 可用平板划线法进行菌种分离。方法如下：用接种管蘸取少量经增殖培养后 的菌液，在含无菌固体培养基的平板表面上进行规则划线，操作时由右向左轻轻 划线，划线时平板面与接种环成 30°～40° ，以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线， 线条要平行密集，使两线不能重叠，充分利用表面积，划线时接种环不要嵌入板 内划破培养基，密集的含菌样品，经过多划线稀释，使菌体在平板培养基上逐渐 分离成单个菌株，经培养繁殖成单个菌落，反复进行几次平板划线分离，可得枯 草芽孢杆菌野生菌株。 1.1.4 菌株的培养 常用培养基配方：1L 蒸馏水+10g 蛋白胨+3g 牛肉膏+15～20g 琼脂+5gNaCl 。 本课题以麸皮、豆饼粉作为天然培养基，在 37℃保温箱中培养，至培养基中部 分出现成熟颜色即可进行保藏。 第 2 页 年产 3 吨中性淀粉酶发酵工艺设计 1.1.5 菌落的选择 初筛采用