免疫学--化学发光免疫.ppt

磁铁 四氧化三铁 2.微粒子捕获法：以无磁性微粒子作为抗体或抗原 的载体, 用纤维膜柱子分离酶标记物的结合状态 和游离状态。 3.包被珠分离法：用聚苯乙稀等材料制成的小珠作 为抗原或抗体的载体,经抗原抗体反应后,将 结合状态和游离状态的酶标记物进行分离. 荧光酶免疫测定技术反应原理图 洗涤 弃上清 是利用理想的酶荧光底物，生成的产物稳定并有 强的荧光强度，通过测定荧光强度进行定量。 化学发光酶免疫测定技术反应原理图 洗涤 弃上清 是利用酶对发光底物催化作用而直接发光，通过光强度的测定而直接进行定量。 化学发光免疫技术 基于抗原抗体反应的免疫学检测技术 凝集反应 沉淀反应 补体参与的反应 荧光免疫反应 放射免疫 酶免疫技术 化学发光免疫技术 金免疫技术 化学发光免疫技术 第一节 发光与化学发光剂 第二节 发光酶免疫测定（CLEIA） （chemiluminescence enzyme immunoasssay） 第三节 化学发光免疫测定技术(CLIA) （chemiluminescence immunoassay） 第四节 电化学发光免疫测定技术(ECLI) (electrochemiluminescence immunoassay) 化学发光免疫技术： 集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。 特点： 特异性高、敏感性高、分离简便、 快速、试剂无毒、安全稳定、 可自动化。 概 念 化学发光免疫技术的类型 按发光剂不同分为 1.发光酶免疫测定（CLEIA） chemiluminescence enzymeimmunoasssay 2.化学发光免疫测定技术(CLIA) chemiluminescence immunoassay 3.电化学发光免疫测定技术(ECLI) electrochemiluminescence immunoassay 按分离方法不同分 1.微粒子化学发光免疫测定 2.磁颗粒化学发光免疫测定 第一节 发光与化学发光剂 一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。 1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。 2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。 3.化学发光:在常温下由化学反应产生的光的发射。 化学发光是一个多步骤的过程。 荧光素酶 ATP；O2；Mg2+ 氧化萤火虫荧光素 萤火虫荧光素 返回 光 + AMP+ O2 + CO2 + 化学发光 机制：某些化合物可以利用化学反应产生的能 量使其产物分子或反应中间态分子上升至电子 激发态。当此产物分子或中间态分子衰退至基 态时，以发射光子的形式释放能量（即发光）。 化学发光剂或发光底物：在化学发光反应中参 与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量 的化合物。 发光剂分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂 ①能参与化学发光反应； ②与抗原或抗体偶联后形成稳定的结合物试剂； ③偶联后仍保留高的量子效应和反应动力； ④应不改变或极少改变被标记物的理化特性， 特别是免疫活性。 化学发光剂应符合以下几个条件 返回 1.酶促反应的发光底物 是指经酶的降解作用而发出光的一类发光底物。 CLEIA中常用的酶有HRP和ALP HRP的发光底物有鲁米诺、对-羟基苯乙酸 ALP的发光底物有AMPPD、4-MUP（荧光底物） 特点：可作标记物、也可作过氧化物酶的底物 1.1 鲁米诺及其衍生物 H2O2 /OH- HRP +N2 + H2O +光 对-羟基苯乙酸（HPA） HPA在H2O2存在下被HRP氧化成氧化二聚体（荧光物质），在350nm激发光作用下，发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测量。 1.2 HPA H2O2 HRP +荧光 氧化二聚体 AMPPD AMPPD在碱性条件下，被ALP解生成相当稳定的 AMP-D阴离子，其有2～30min的分解半衰期，发 出波长为470nm的持续性光，在15min时其强度 达到高峰，15～60min内光强度保持相对稳定。 光 ALP /OH- 1.3 AMPPD HPO42- 4-MUP 4-MUP被ALP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的激发光的作用下，发出448nm的荧光，可用荧 光光度计进行测量。 荧光 ALP 1.4 4-MUP 4-MU 360nm 激发光 H3PO4 + 2.直接化学发光剂 特点：不需催化剂，只需