SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程(12%胶).docVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳标准操作规程（12%胶，14.4-97KD） 1电泳各试剂的配制 凝胶贮液：Acrylamide/Bis (30%T，2.67%C)——为聚丙烯酰胺 取丙烯酰胺acrylamide 29.2 g、双丙烯酰胺N′N′-bis-methylene-acrylamide 0.8 g至100mL量瓶中，加去离子水至刻度，摇匀，过滤。4℃避光储存。 1.2 即10%的过硫酸铵 10%APS（临用现配） 称取过硫酸铵（ammonium persulfate）100 mg，加1mL去离子水溶解。 1.5M Tris-HCl，pH 8.8 称取Tris base 18.15 g 于量瓶中，加去离子水80mL，用HCl 调节pH 8.8，再加去离子水至总体积100mL。4℃储存。 0.5%（w/v）溴酚蓝：溴酚蓝0.5g，去离子水定容至100mL。 0.5M Tris-HCl，pH 6.8：称取Tris （三羟甲基氨基甲烷）6 g 于量瓶中，加去离子水60mL，用HCl 调节pH 6.8，再加去离子水至总体积100mL。4℃储存。 10%（w/v）SDS：称取10g SDS至100ml量瓶中，加90ml去离子水，缓慢搅拌至溶解，再加去离子水至刻度。 1.3 凝胶配制 按下表比例配制凝胶 水/mL Acr/Bis（30%）/mL 1.5M Tris-HCl，pH 8.8/mL 0.5M Tris-HCl，pH 6.8/mL 10%SDS/mL 12%分离胶 3.4 4.0 2.5 — 0.1 5%浓缩胶 5.7 1.7 — 2.5 0.1 分离胶及浓缩胶按上表比例配好后，均需脱气15 min。临灌胶前，往分离胶中加入100 μl 10%APS及10 μl TEMED；往浓缩胶中加入100 μl 10%APS及20 μl TEMED（各试剂按比例增减）。 其中：TEMED为催化剂 1.4 10×电极缓冲液，pH 8.3 称取Tris base 30.3 g、Glycine（甘氨酸） 144 g、SDS 10.0 g于1000 mL量瓶中，溶解，加去离子水至刻度，不调pH。4℃储存。临用前，取出放至室温，10倍稀释，混匀，即为电极缓冲液。 1.5 样品溶解液S 去离子水 3.55mL； 0.5M Tris-HCl，pH 6.8 1.25mL； glycerol （甘油 ） 2.5mL 10% (w/v) SDS 2.0mL 0.5%（w/v）溴酚蓝 0.2mL 总体积为9.5 mL。室温储存。临用前加50 μl β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol）于950 μl 样品缓冲中，即为样品溶解液。 染色各试剂的配制 2.1 固定液：50%乙醇，12%冰醋酸，0.1%甲醛（即250ml无水乙醇+60ml冰醋酸+0.5ml甲醛+去离子水至500ml） 2.2 洗涤液：50%乙醇（500ml无水乙醇+500ml去离子水） 2.3 敏化液：0.02%无水硫代硫酸钠（62.78mg五水硫代硫酸钠，加去离子水定容至200ml） 2.4 染色液：0.5% 硝酸银，0.075%甲醛（临用现加）（0.5g硝酸银+100ml去离子水+197ul甲醛）甲醛临用现加 2.5 显色液：6%无水碳酸钠，0.0004%硫代硫酸钠，0.05%甲醛（临用现加）（即60g无水碳酸钠+6.28mg五水硫代硫酸钠+去离子水至1000ml作为显色贮备液，每次用时取100ml+132ul甲醛即得） 2.6 终止液：50%乙醇，12%冰醋酸（250ml无水乙醇+60ml冰醋酸+去离子水至500ml即为终止液） 以上均用去离子水配制。 针晶提取 取新鲜天南星科药材，去皮。 切碎至约3 mm 将已切碎的药材置于大小适宜的洁净研钵中，加入2倍体积石油醚（60~90°）研磨，每次约5~10 min，反复多次。 将石油醚溶液倒出，经4层医用纱布过滤，合并滤液，用孔径0.22 μm的偏氟膜抽滤，得滤饼。 取滤饼适量于离心管中，加入30倍体积的四氯化碳，混匀，8000 rpm 离心3min（三楼），去除四氯化碳液，反复3次。 离心后的下层沉淀中加入石油醚（60~90°）适量，混匀，用孔径0.22 μm的偏氟膜过滤，得滤渣，即为毒针晶蛋白纯化的样品。 实验步骤 样品制备 精密称取半夏及其它样品纯化毒针晶蛋白适量，分别以移液枪加入样品溶解液，使浓度为30 μl/mg混匀（，将各样品液及未预染标准蛋白于沸水浴中加热5 min后，置于高速离心机中，10000 rpm离心3 min（五楼）。 上样 精密吸取各样品液10 μl、标准蛋白液5 μl，按电泳仪使用说明中的上样方法上样