植物DNA和RNA提取方法.pdfVIP

实验一 植物基因组 DNA 的提取 一、实验目的 掌握植物总 DNA 的抽提方法和基本原理。 学习根据不同的植物和实验要求设计和改良 植物总 DNA 抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类 (尤 其是氧化酶类 ) 对 DNA 的抽提产生不利的影响， 在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂 (如巯基乙醇 ) 以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各 种酶类的作用。 十 二 烷 基 肌 酸 钠 (sarkosyl) 、 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 铵 (hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为 CTAB) 、十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate ，简称 SDS)等离子型表面 活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使 DNA 得以游离出来。再加入苯 酚和氯仿等有机溶剂， 能使蛋白质变性， 并使抽提液分相， 因核酸 (DNA 、RNA) 水溶性很强， 经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 上清液中加入无水乙醇使 DNA 沉 淀，沉淀 DNA 溶于 TE 溶液中，即得植物总 DNA 溶液。 三、 实验材料 水稻幼叶 四、主要试剂配方 2% CTAB 抽提缓冲溶液 : CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml ，先用 70ml ddH 2O 溶解 , 再定容至 200ml 灭菌 , 冷却后 0.2-1% 2- 巯基乙醇 （400ul ） 氯仿 -异戊醇（ 24 ： 1）：先加 96ml 氯仿，再加 4ml 异戊醇，摇匀即可。 五、实验步骤 1. DNA 的提取 （1） 2%CTAB 抽提缓冲液在 65℃水浴中预热。 （2 ）取少量叶片（约 1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； （3） 加入 700ul 的 2%CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动； （4 ） 将磨碎液分倒入 1.5 ml 的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二； （5）置于 65 ℃的水浴槽或恒温箱中，每隔 10 min 轻轻摇动， 40 min 后取出； （6）冷却 2 min 后，加入氯仿 -异戊醇（ 24 ：1）至满管，剧烈振荡 2~3 min ，使两者混 合均匀； （7）放入离心机中 10 000 rpm 离心 10 min ，与此同时，将 600 μl 的异丙醇加入另一新 的灭菌离心管中； （8） 10 000 rpm 离心 1 min 后，移液器轻轻地吸取上清夜， 转入含有异丙醇的离心管， 将离心管慢慢上下摇动 30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到 DNA 絮状物； （9）10000 rpm 离心 1 min 后，立即倒掉液体，注意勿将白色 DNA 沉淀倒出，将离心 管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec 后，直立离心管，加入 720 μl 的 75% 乙醇及 80 μl 5 M 的醋酸钠，轻轻转 动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的 DNA 块状物浮游于液体中； （11）放置 30 min ，使 DNA 块状物的不纯物溶解； （12）10000 rpm 离心 1 min 后，倒掉液体， 再加入 800 μl 75% 的乙醇，将 DNA 再洗 30 min ； （13）10000 rpm 离心