绿色荧光蛋白 特性及其在分子生物学研究中 应用.ppt

绿色白GFP的特性及 公子生物学研究中 的应用  生物发光现象,在无脊椎动物中很普遍。它是生物能量的一种转换方式 [1,2]。在水母( Jellyfish)中,当能量从Ca++活化的水母蛋白( A equo )转移到绿色荧光蛋白( Green F luo rescen t P ro tein,简称GFP)上以 后,它即发出绿色荧光。活体GFP与纯化的GFP具有相同光谱特性 即吸收藍光,放射绿光。可以用紫外灯、荧光显微镜或荧光活化流体分 光光度计进行活体检测。出于GFP稳定、灵敏度高、无生物毒性、荧 光反应不需要任何外源反应底物及表达无物种或细胞组织的专 此它是一种独特的报告蛋直 R epo rter p ro tein),可广泛用于基因的表 达与调控、馓白质的定位、转移及相互作用、信号传递、转染与转化, 以及细胞的分离与纯化等研究领域。90年代后,有关GFP及其利用的研 究进展较快,已引起分子生物学家极大的兴趣与关注  GFP的结构、特性与功能 GFP的结构 P rasher DC首先克降了水母 Jellyfish(A equorea v ictoria GFP)的cDNA[6].GFP編码的238个氫 基酸的多肽单 推导分子量M=26888,与先前用变性电泳测得的天然GFP分子量(30KDa 接近。根据DNA序列推导的基酸序列与大部分天然GFP的多肽片段相同。只有完整的GFP分子才会 但与荧光的产生直接有关的是GFP分 称为色基 Ch rom pho re)的部位 图2。在GFP的初级氨基酸序列上,第6567个氨基酸( Ser Tyr G 形成环状六馱三体,以共价形式与GFP蛋白肽键骨架相连。色基形成的机理日前尚不清楚,但在有分 氧仔在的条件下,酪氨酸氧化成脱氢酪氨酸,并环化形成六肽,这可能是形成色基的必然过程。 Sh im on ura最先推导了水母GFP色基结构 来Ward等进行了 验证与修改。GFP的cDNA克降序列 析表明,在2.6kb范围内全少分布有3个岸动子,组成色基的 Ser Tyr Gly体就位于第二个内含」3 CELT  2GFP的光谱特性 F发的光谱峰算为5352m)并车有56m7C ( Shouder).GFP的光谱特性与荧光紊异硫氰酸盐(FTC)很相似,因此为荧光素 光)是GFP的副吸收峰,H子长波能量低,细胞忍受能力强,此更适合子活体检 Chroma技术公司 Chroma Technology Corp. Brattleboro,vT05301,USA)已 研制出一系列适合于GFP观察的滤光片组合。利用重组突变[10,11,12]和数字联 想分光显微镜( Digital Imaging Spectroscopy)技术[13,14,15可以诱 色基 突变,改变GFP光谱特性。HemR等[16,17获得了野生型GFP的一系列随机突变 其激发波长和发射波长都发生了变化(表1)。如获得的蓝色荧光突变,就是原GFP 分子中第66个氨基酸由酪氨酸突变成的组氨酸,但荧光信号减弱了近50%。 Delagrave S获得的红色漂移(Red- shifed)突变,与野 FP相比,其激发波长向 红色方向漂移了近100nm[18]。具有不同光谱特性的GFP突变体的获得,使在同 细胞中同时分析两种不同蛋白或启动子成为可能,可以用于发育细胞学、药物 筛选、分析诊断等硏究  3GFP的稳定性 GFP荧光极其稳定,在荧 照射下GFP抗光漂白( Photo 10mM还原谷胱甘 并 对 烯酰胺 足琴旋题 因此GFP