演示课件PCR技术7.ppt

不对称PCR的应用 不对称PCR制备的ssDNA，主要用于核酸序列测定. 用于探针的制备 优选 * 反转录PCR reverse transcription PCR，RT-PCR，RNA-PCR 以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成出cDNA第一链；cDNA以自身为模板合成出互补第二链 优选 * 反转录酶 mRNA cDNA第一链 合成 变性退火 延伸 cDNA 优选 * RT-PCR 优选 * RT-PCR 优选 * RT-PCR操作步骤 优选 * RT-PCR的应用 克隆cDNA。 检测RNA 合成cDNA探针 用寡聚胸腺嘧啶（polyT）和另一随机引物配对，可以制备基因表达文库 优选 * 常用的反转录酶 RT-PCR的关键步骤是RNA反转录 用作模板的RNA可以是总RNA，但不能混有DNA、Pr等，尤其不能混有RNA酶，因此要严格进行RNA纯化 AMV：鸟类成髓细胞白血病病毒反转录酶 MML：莫洛尼鼠类白血病病毒反转录酶 优选 * 反向PCR reverse PCR 常规PCR只能扩增两端序列已知的目的基因，即两引物之间DNA片段。 反向PCR是用反向的互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段 优选 * 原理 选择已知序列内部没有切点的限制性内切酶对靶DNA两端序列进行酶切，最好使所产生的带有靶DNA的区段不大于2-3kb。 用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接 用一对反向引物（outwardly-facing primers）进行PCR，其扩增产物将含有两引物外未知序列，从而对未知序进行分析研究. 优选 * 酶切位点 酶切 引物1 引物2 连接 PCR 优选 * 反向PCR的应用 对染色体DNA进行染色体步查（Chromosome Walking） 但能被反向PCR扩增的DNA长度是有限的，因此它只能沿着染色体分子作较短的步移 用于对未知序列的测序 优选 * 锚定PCR Anchored PCR，A-PCR 用酶法在反转录的cDNA3’端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点，对该cDNA进行PCR扩增的技术 优选 * GGGG GGGG CCCC GGGG CCCC mRNA cDNA 逆转录酶 末端转移酶 引物 PCR 锚定引物 特定引物 优选 * 锚定PCR的应用 构建低丰度的cDNA文库 分离与一段已知序列相邻的未知序列 扩增特定的cDNA片段可用于制备探针 优选 * 修饰引物PCR Modified primer PCR PCR引物在合成过程中对5‘端进行修饰，不但不影响扩增反应的进行，而且方便了产物的分析 还可将一些信号分子，如荧光素、生物素等连接到引物的5‘末端 引物修饰类型 优选 * 彩色PCR Color PCR 着色互补PCR，color complementation PCR 荧光PCR，fluroscent PCR 用不同颜色的荧光染料标记引物的5端，因而扩增后的靶基因序列分别带有引物5的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况 优选 * 出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带 优选 * 出现片状拖带的原因 酶量过多或酶的质量差 dNTP浓度过高 Mg2+浓度过高 退火温度过低 循环次数过多 优选 * 出现片状拖带的对策 减少酶量，或调换另一来源的酶 减少dNTP的浓度 适当降低Mg2+浓度 增加模板量 减少循环次数。 优选 * 污染原因 1、标本间交叉污染 标本污染主要有收集标本的容器被污染 标本放置时，由于密封不严溢于容器外 容器外粘有标本而造成相互间交叉污染 标本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染 有些微生物标本尤其是病毒可随气体扩散，导致彼此间的污染. 优选 * 污染原因 2、PCR试剂的污染 主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染. 优选 * 污染原因 3、PCR扩增产物污染，这是PCR反应中最主要最常见的污染问题 因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染；在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题 优选 * 污染原因 4、实验室中克隆质粒的污染 在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见。因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞