高效液相色谱法(HPLC)PPT参考幻灯片.ppt

3、离子交换色谱 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH- 固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ； 阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液； 应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。 * 4、离子对色谱 基本原理：离子对色谱法是分离分析强极性有机酸和有机碱的极好方法。将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，控制溶质离子的保留行为使其两相之间进行分配； 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子； 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X- 进入流动相后，生成疏水性离子对Y+ X -后；在两相间分配。 * 举例：维生素类药物的分析 维生素具有脂溶性和水溶性两大类，由于其化学结构和性质相差较大，在含水介质中，又要受到光、空气、温度和pH的影响，使测定结果不理想。因而，提出用甲醇和水都能溶解的樟脑磺酸，作为离子对试剂，以二巯基丙烷磺酸钠0.125g/ml作为抗氧化剂，能使被测样品处于稳定的初始状态，结果更为可靠。 * 反相离子对色谱 是分离有机离子的有效方法，离子对试剂和其他添加剂的选用规则：1.样品中含有—COOH,—SO3H基团时，选用的离子对试剂应是带正电荷的有机铵盐，以增加样品阴离子在反响色偶中的保留值，选用的流动相一般是甲醇/水；2.除了加入离子对试剂，还要加入磷酸盐或者其他缓冲液，以控制流动相的酸度；3.样品中含有—NH2和—NH基团或其他阳离子时，选用的离子对试剂应是烷基磺酸盐或硫酸盐；4.样品同时含有—NH2，—COOH,—SO3H等不同性质的基团时则以上规则选用的离子对试剂和添加剂都合理。 * 举例：芳酸及其酯类药物分析 合成氨基水杨酸钠时，以间氨基酚为原料的生产路线较为普遍，因此在成品中可能含有未完全反应的间氨基酚。USP(24)采用离子对高效液相色谱法检测间氨基酚的限量。 色谱条件：填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶(C18,10um)；色谱柱为250mmX46mm；流动相为磷酸二氢钠液(0.05mol/L)—磷酸氢二钠液(0.05mol/L)—甲醇(含氢氧化四丁基铵1.9g)(425:425:100)；检测波长为254nm；流速为1.5ml/min。 * 5、离子色谱 离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。 为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。 * 阳离子交换：R—H + Na+OH- ＝ R—Na + H2O R—H + Na+Br- ＝ R—Na + H+Br- 阴离子交换：R—OH + Na+Br- ＝ R—Br + Na+OH- 使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为离子色谱。 若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。 * 双柱型离子色谱装置图 离子色谱连续抑制装置图 * 6、空间排阻色谱 原理：又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。 小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；可对相对分子质量在103-105范围内的化合物按质量分离 * 7、亲和色谱(AC) 原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力