单向双向免疫琼脂扩散.pptVIP

实验 单向、双向免疫琼脂扩散 沉淀反应 可溶性抗原（如细菌外毒素、血清蛋白等）与相应抗体特异性结合后，在一定条件（适量电解质、适宜的pH值及温度）下，经过一定时间，在比例适宜处形成肉眼可见的沉淀现象。 沉淀反应 沉 淀 反 应 环状沉淀反应 絮状沉淀反应 琼脂扩散试验 双向扩散 单向扩散 ＋ 电 泳 技 术 火箭免疫电泳 对流免疫电泳 单向免疫琼脂扩散 实验原理 将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原，抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。 实验原理 此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。 沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原制成标准曲线，从标准曲线上，可以查出待检样品中抗原的含量。 实验原理 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度 绘制标准曲线 标准品抗原浓度测定 不同病人抗原浓度测定 实验方法 （一）标准曲线的制备 制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL）。 首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。 实验方法 稀释抗体：用pH7.2的PBS稀释标准兔抗牛IgG血清抗体，使最终浓度为抗体效价的一倍，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。 制备琼脂板：将已稀释的标准兔抗牛IgG血清抗体于56℃水浴中预热半分钟，再倾注于已溶化并维持56℃的2%盐水琼脂中混匀，取4ml即刻倾注于玻片上，待凝固后即可。 实验方法 打孔：将琼脂板置于模板上，在同一直线上用打孔器打孔5个，孔距10mm。 用PBS缓冲液稀释不同浓度的标准参考蛋白。（牛免疫球蛋白IgG，应根据制品说明进行稀释） 加样：将已稀释的不同浓度的标准参考蛋白依次用微量加样器每孔加入10ul。（注意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。 实验方法 将加样的琼脂板放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。　　 用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。 实验结果 用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。 实验结果 注意事项 制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性； 加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致； 加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察； 注意事项 加样时，吸取每份标本均应更换塑料吸头； 实际检测过程中，标准曲线必须与样品测定同时制备； 孵育时间应控制在24~48h，时间太短可能产生不了沉淀线，时间太长会造成沉淀线的扩散。 双向免疫琼脂扩散 实验原理 可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线。 实验原理 沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。 当抗原抗体存在多个系统时，可呈现多条沉淀线乃至交叉反应。 依据沉淀线的形态、清晰度及位置可以了解抗原或者抗体的性质。 双向琼脂扩散试验的应用 检测未知抗原或抗体 抗原性质分析 抗体效价滴定 抗原或抗体纯度鉴定 检测未知抗原或抗体 A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似； B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab ； D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似； E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ； F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ； 抗原性质分析 (1) 沉淀线吻合： 待检抗原与标准抗原完全相同。 (2) 沉淀线相切： 待检抗原中含有与标准抗原相同的抗原，还含有另外的抗原与抗血清相对应。 实验方法 (3) 沉淀线相交： 待检抗原有与抗血清对应的抗原，但和标准抗原不同。 (4) 沉淀线部分吻合： 待测抗原和标准抗原性质相同，但含量较低。 抗体效价滴定 周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。 抗原抗体纯度鉴定 “1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。 实验方法 制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL），溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。 将载玻片置于水平桌面上，倾注已融化1%盐水琼脂，制作琼脂板。 琼脂凝固后，用打孔器打孔，本实验采用梅花型。 实验方法 加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。