实验的内容、流程和注意事项.pdfVIP

实用标准文案 1. 酵母 TAN1 homologous genes （AT1G09290 （ TAN1-1 ） ： WiscDsLox393-396C14 / Stock: CS854229； SALK_119543C（鉴定结果均为 WT，需要再订其他突变体）熊峰已做） AT5G12410 （TAN1-2 ）： SALK_045222.54.80.x (Stock:SALK_045222C) ； SAIL_825_C11(Stock: CS836813) 2. Mata1 homolog AT2G01430 ATHB-17, HB17 突变体 : SALK_075942; SALK_128560 3. WD40 家族基因的突变体 实验内容和流程： Part I ：突变体表型： 1）首先将突变体种子播种到 0.5MS 培养基 , 萌发后生长 10 d 左右移到培养基 质于温室生长 2 周左右。期间准备好引物 . 2) 提取基因组 DNA，用引物 LP+RP和 LB+RP分别进行 PCR鉴定（要有对照），需 要得到纯合体 2-3 株和杂合体 2-3 株。 注意：不必将所有生长的植株都提取 DNA进行鉴定，我们只需要纯合体 2-3 株 和杂合体 2-3 株即可 （将没有用拟南芥植株及早剪掉， 千万不要收这种鉴 定是 WT植株的种子）， 对初步确定的杂合体和纯合体：要重复进行一次 PCR鉴定 . 并注意有些突变体可能没有纯合体，鉴定到 2-3 株杂合体即可。 一定要单株收种子； 收种子时注意防止其它植株种子混入 （将各植株尽早分开）。 3 ）纯合体：观察纯合体表型：先播种到 0.5MS，移到基质于温室生长。首先确 定在 MS培养基上（垂直培养）和温室中植株是否和 WT类似（营养生长阶段） 。 若突变体营养生长正常（和 WT相近）： 开花后 10d 左右观察种子败育情况；取 接近成熟的、长度最长的角果进行乙醇脱水观察种子败育情况并进行统计。若 突变体植株比 WT矮小，则不必观察突变体以上所列的种子发育情况，只需照张 照片保存。 注意一定要同时播种真正的 WT材料作为对照。 4 ）杂合体，选取单株收种子的 1 株杂合体植株的种子（ 100 粒左右），播种在 0.5MS 培养基上，待小苗长出子叶（ 2 周左右）后提取 DNA，PCR鉴定基因型， 统计纯合体 : 杂合体 :WT 分离比（不符合孟德尔定律的，作为我们的研究对象进 行下一步实验）。 注意：不必移苗到温室生长。 Part II ：基因表达模式和亚细胞定位 1）构建 基因启动子 :GUS表达载体，转化 野生型拟南芥 。收到的种子经抗生素 筛选、 PCR鉴定得到转基因株系，选 3 个转基因株系进行 GUS染色，研究其时空 表达模式。 2) 构建 基因启动子 : 基因 --GFP 表达载体， 转化相应的突变体 。收到的种子经抗 生素筛选、 PCR鉴定得到转基因株系，观察 GFP荧光在细胞内的分布确定该蛋白 的亚细胞定位。 精彩文档 实用标准文案 突变体基因型鉴定 流程 1. 核实突变体引物序列，插入位点、方向信息： 举例： 1）At2g19540 SALK_014373 正向插入 插入位点： NO9 intron （/cgi-bin/tdnaexpress ） Isect primers ：找到引物序列 LP GTGTCTCTTGGGCAGATTCT