GB2020进境牧草种子细菌的高通量检测技术规范-标准全文及编制说明.pdfVIP

GB2020进境牧草种子细菌的高通量检测技术规范-编制说明.pdf GB2020进境牧草种子细菌的高通量检测技术规范.pdf 国家标准《进境牧草种子细菌的高通量检测技术规范》编制说明 1. 目的和意义 近几年来，随着全国对生态保护、环境建设、畜牧业推进和城市绿化美 化的持续关注，作为生态环境建设、改良天然草地、建立人工草地和进行城市绿 化美化的重要物质基础的牧草和草坪草种子，其需求量逐年增加。牧草种子进口 数量增长之快，固然满足了我们城市建设的需要，但增长量如此之大，有害生物 传入的风险也随之迅速增加。但从我们目前检出有害生物，尤其是检疫性有害生 物的情况来看，可能是进口国对于种子质量的管理水平严格，进口数量虽大，种 类虽多，但其携带检疫性病原菌数量确实不多，风险不大，但也有可能是我们目 前的检测手段、检测方法相对滞后，仅根据审批单，仅根据现有已知检测对象进 行的检测，仅依靠现有方法的灵敏度，不足以检出可能引起我们关注的目标。尝 试使用比现有方法更高的灵敏度、更有针对性的检测方法，以应对现在牧草种子 数量增长带来的高风险问题。快速、准确的种类鉴定是实现货物快速通关的关键， 但目前我国尚未建立围绕进境牧草种子携带细菌的高通量检测技术规范，因此迫 切需要建立进境牧草种子的高通量检测技术规范，为进境牧草种子携带细菌的鉴 定及病原菌的风险评估提供标准和依据，缩减检测时间，提高检测效率，实现货 物的快速通关。 2.标准编制的主要工作过程 2.1 任务来源 该项目由国家标准委于2018年立项，计划编号T-469 。主要由 中华人民共和国北京海关技术中心和江西农业大学共同完成。 2.2 立项研究阶段 该标准立项后，标准起草小组立即开始进行调研工作。起草人员为了科学 地制定标准，通过多种方式大量收集了国际上有关进境牧草种子细菌的高通量检 测技术规范的资料，对该检验方法、最新研究进展进行了全面、细致的了解和研 究，为该标准的制定奠定了基础。 2.2.1 DNA 样品检测 样品信息 样品类型 样品数量 样品体积 备注 DNA 提取液 4 50 μL 牧草种子 琼脂糖凝胶电泳检测 利用 CTAB 法提取基因组 DNA ，配置 1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，确 定DNA 无降解。 2.2.2 扩增引物筛选 16S rRNA 基因，存在于所有细菌中，被广泛用于评估微生物群落的多样性， 全长约1600 bp ，包含9 个可变区（Variable Regions ）和10 个保守区（Constant Regions ），保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能体现物种 间的差异。基于16S rRNA 基因序列的分析在微生物分类鉴定、微生态研究等方 面起到重要作用。其中V4 区是指第四个可变区515-806 bp 这个区域，长度约为 290 bp 。而V3-V4 区是指第三和第四两个可变区341-806 这个区域，长度约为460 bp ，比V4 区携带更多的遗传信息。 Thijs 等 （2017 ）研究结果表明相对于V1-V3 、V3-V4 、V5-V7 和V6-V8 ， V3-V4 能获得更多的OTU ，物种多样性最高。（Thijs, S., De Beeck, M. O., Beckers, B., et al. Comparative Evaluation of Four Bacteria-Specific Primer Pairs for 16S rRNA Gene Surveys[J]. Frontiers in Microbiology, 2017, 8: 494. ） Wear 等 （2018 ）通过对沿海海洋浮游微生物的 16S rRNA 基因 V1-V2 、 V3-V4 、V4 和V4-V5 区进行分析，结果表明V3-V4 区物种分辨率最高。（Wear, E. K., Wilbanks, E. G., Nelson, C. E., et al. Primer selection impacts specific population abundances but not community