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蛋白表达纯化实验步骤（待改进） 1、 取适当相应蛋白高表达的动物组织提 total-RNA 。 2、 设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的 酶切位点和保护碱基。 3、 RT-PCR，KOD 酶扩增获取目的基因 c DNA. 4、 双酶切，将 cDNA.克隆入 PET28/32 等表达载体。 5、 转化到 DH5α感受态 菌中扩增，提质粒。 6、 将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如 Bl21 （DE3）、Rosetta gami （DE3）、Bl21 codon （DE3）等。 7、 蛋白的诱导表达。 1） 将表达菌株在 3ml LB 培养基中摇至 OD=0.6 左右，加 入 IPTG，浓度梯度从 25μM 到 1m M。37 度诱导过夜(一般 3h 以上即有大量表达)。 2） SDS电泳检测 目的蛋白的表达。注：目的蛋白包 涵体表达量一般会达到菌体蛋白的 50%以上，在胶上可以看到 明显的粗大的条带。 3） 将有表达的菌株 10%甘油保种，保存 1ml 左右就足够了， 并记录 IPTG 浓度范围。甘油是用 0.22μm 过滤除菌的，储存浓 度一般是 30%-60%，使用时自己计算用量。 4） 用上述 IPTG 浓度范 围的最低值诱导 10ml 表达菌，18 度，低转速（140-180rpm），诱导过夜作为包涵体检测样品。 注意：1.如果表达的蛋白对菌体有毒性，可以在加IPTG 之前的 培养基中加入 1%的葡萄糖用来抑制本底表达。葡萄糖会随着 菌 的繁殖消耗殆尽，不会影响后面的表达。2.保种可以取一部分分 成 50μl 一管，每次用一管，避免反复冻融。 8、 包涵体检测。方案见 附件 2 9、 如有上清表达，则扩大摇菌。 1） 取保种的表达菌株先 摇 10ml，37 度， 300rpm 摇 至 OD=1.5，约 5h 左右，视菌种的活性而异，也可过夜摇菌。 2） 将上一步中的 8ml 加入 300ml 培养基中 37 度，250rpm 摇至 OD= 1.0 左右（约 2.5h~3h），然后加 IPTG （浓度同包涵体检 测中使用的浓度。）注：菌液浓度要适当的浓一些，否则第二天 收集不到足够的菌体，因为低温低转速 菌生长非常缓慢。拿 起锥形瓶对光摇动，看到有大量云雾状菌体即可。另一方法是， 将手指放在瓶底晃动，看不清手指为宜，不过此法宜受气泡影 响。 3） 过夜摇菌，使用包涵体检测的温度（18°左右），转速 140rpm 左右。 4） 将菌液 6000rpm，4min，4 度 离心收集菌体。加入 20mM PBS，洗一遍后用平衡缓冲液重悬。每 250ml 菌液用 30 ml 到 50ml 平衡缓冲液，视菌液的浓度而定。可用 4 支 50ml 的 离心管同时离心，但是，离心管要重复使用，用完后洗净保存。 10、 超声波裂解。 1） 用 6mm 变幅杆，35%功率，3.5s 工作，7s 休息，50min 即 可。 注意：1.要冰浴。2.要随时观察裂解情况以防意外。3.要将探 头探入到溶液中下部，尽量不要打出大量气泡。一般溶液量比 较大的时候不会出现大量气泡。 4.正常声音为：孜孜声，尖锐刺耳的声音表明探头位置不对 或者功率太大或者探头松动等原因，要及时调整。溶液由浑浊 变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面 3000 转离心时，如 果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作 30 分 min 要休 息 5min （即关闭总电源开关）。 注意 ：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之 前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF 工作浓度为 1%。2.如不能 判断是否裂