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蛋白质的提取与检测 第一节 细胞总蛋白的提取及含量测定 【基本原理】 蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法 之一。目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret 法）、 Folin-酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有两种近年普遍使用 起来的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）与二辛可宁酸法（BCA 法）。值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式 的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的 结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时 应考虑：①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③ 溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时 。 Lowry 法：蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸 展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应 并产生深蓝色，在 750nm 有最大光吸收值。在一定浓度范围内，反应 液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同 种蛋白质作标准。 Bradford 法：蛋白质与染料考马斯亮蓝 G-250 结合，使得染料最大 吸收峰从 465nm 变为 595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。在一定 的线性范 围内，反应液 595nm 处吸光度的变化量与反应蛋白量成正 比，测定 595nm 处吸光度的增加即可进行蛋白定量。 BCA （Bicinchoninic acid）法：二价铜离子在碱性的条件下，可以被 1 蛋白质还原成一价铜离子（Biuret reaction）并与 BCA 相互作用产生敏 感的颜色反应。两分子的BCA 螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合 物。该水溶性的复合物在 562nm 处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白 浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓 度。 【试剂配制】 1. 1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF ：0.174g PMSF 溶解于 100ml 异 丙醇，分装于 1.5ml 离心管中，-20℃保存。 2. 细胞裂解液：50mM Tris-HCl （pH 7.4），150mM NaCl，1mM PMSF，1mM EDTA，1% Triton X-100，4℃保存。 3. 100mg/ml 牛 血 清 白 蛋 白 （ BSA） ： BSA 0.1g， 0.15mol/L NaCl 1ml ，充分溶解后-20℃保存。 4. 0.15mol/L NaCl ：0.877g NaCl 溶解于 100ml 去离子水，高温 灭菌后室温保存。 5. 考马斯亮蓝 G250 溶液：考马斯亮蓝 G250 100mg，95% 乙醇 50ml，磷酸 100ml ，加去离子水至 1L。先用乙醇溶解考马斯亮蓝 染料，再加入磷酸和去离子水，混匀后滤纸过滤，4℃保存。 6. PBS 缓冲液（pH 7.4）：NaCl 8g ，KCl 0.2g，Na HPO •12H O 2 4 2 3.63g，KH PO 0.24g ，溶解于 900ml 双蒸水中，用盐酸调 pH 值至 2 4 7.4，加去离子水定容至 1L，常温保存备用。 【操作步骤】 一、细胞总蛋白的提取 1. 人乳腺癌细胞系 MCF-7、MDA-MB-231 与食道癌细胞系 EC109 于含 10% FBS 的 DMEM 培养基，37℃、5% CO 条件下 2 2 规培养。 2. 去除培养液后以预冷的 PB