蛋白质复性方法及其注意事项.pdfVIP

蛋白质复性方法及其注意事项 蛋白前期准备 （1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。 （2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加 1-2mMDTT，全程低温， 及时处理。 （3）透析 Buffer 的选择可参考文献。 蛋白复性 包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大 分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露 构，这 种水不溶性的 构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 在 E.coli 中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来， 这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。 包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、 纯化及复性。 如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1） 退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及 复性。这里主要考虑第二种方案。 包涵体的洗涤 1 破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使 大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还 可通过选择 pH 、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质 的提取。 洗涤 Buffer ：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT， 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。 超声时用 40-60ml 裂解液,因为我们的超声仪很适合用 100ml 小 烧杯,装 40-60ml 裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来. 菌多就延长超声时间（全程冰浴）。 包涵体的溶解 1、对于尿素和盐酸胍的选择 ： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它 们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素 8-10M，盐 酸胍 6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素 在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨 基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质 复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种 色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达 95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质 2 的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去 可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。 2 、去垢剂： 温和去垢剂 TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜蛋白。如强的阴离 子去垢剂 SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以 增溶几乎所有的蛋 白。问题是由于 SDS 无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。 包涵体的复性 1 复性： 通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复 到正常的折叠 构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。 2 复性的效率： 复性是一个非常复杂的过程，蛋白质的复性效率在 20%左右。影 响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速 度、温度、pH 、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在 与否等。 4、复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大， 变性剂稀释速度太快，不易控制。 透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制 变性剂去除速度，缺点是易形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应 3 用到生产规模。 超滤复性：在生产中较多的使用，规模较大，易于对透析速度进行 控制，缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程 中不可逆的变性。