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实验九 蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法 目的要求 学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度 的原理和方法。 实验原理 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的 原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。 考马斯亮蓝 G―250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝 色。它和蛋白质通 范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白 质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色 有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由 465nm 变成 595nm，通过测定 595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。 蛋白质和染料结合是一个很快的 程，约 2min 即可反应完 全，呈现最大光吸收，并可稳定 1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚 合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测 定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质 5µL/ml 时就有 0.275 光吸收值的变化，比 Lowry 法灵敏 4 倍，测定范围为 10－100µg 蛋白质，微量测定法测定范围是 1－10µg 蛋白质。此反应重复性好，精 确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是 由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与 蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。 此方法干扰物少，研究表明：NaCl ，KCl，MgCl ，乙醇，（NH ） 2 4 SO 无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的 2 4 缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA 及微量的去污剂如 Triton X―100 ，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰， 用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影 响太大而不易消除。 试剂与器材 一、试剂 考马斯亮蓝试剂： 考 马 斯 亮 蓝 G―250 100mg 溶 于 50ml95% 乙 醇 中 ， 加 入 100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至 1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含 0.01%(W/V)考马斯亮蓝 G―250，4.7%(W/V) 乙醇。 二、标准和待测蛋白质溶液 1．标准蛋白质溶液 结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据 其纯度用 0.15mol/LNaCl 配制成 1mg/ml，0.1mg/ml 蛋白溶液。 2．未知蛋白质溶液。 三、器材 试管及试管架， 移液管（0.1ml 及 5ml），UV －2000 型分光光度计。 操作方法 一、标准法制定标准曲线 取 14 支试管，分两组按下表 a 平行操作。 绘制标准曲线：以A595nm 为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐 标纸上绘制标准曲线。 表 a 试管编号 0 1 2 3 4 5 6 1mg/ml 标准蛋 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0 白溶液/ml 1 2 3 4 5 6 0.15mol/L 0.0 0.0 0.0 0.0