蛋白质相互作用的主要研究方法.pdfVIP

蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其 基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重 要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性 虽然有一些蛋 白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分 子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了 更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物 的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中， 蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同 的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发 生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、 接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身 来的假阴性或假阳性 蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting 、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共 振、荧光能量转移等几种 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一 性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋 白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法 其基本原理是:细胞 裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免 疫复合物，然后进行SDS及Western blotting分析。免疫共沉淀既 可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知 的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要 用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白 质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS鉴定。免疫共沉 淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比 较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的 细胞系作为阴性对照等等 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点： （1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非 特异蛋白 单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗 体的特异性。即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共 沉淀。（3）确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞 的溶解才发生的 这需要进行蛋白质的定位来确定 免疫共沉淀试验也同样不能保证沉淀的蛋白复合物是否为直接 相互作用的两种蛋白。例如E1A与p60 的共沉淀就是间接的相互作用 其实际上是E1A与p107直接相互作用，而p107与p60直接相互作用的结 果。与蛋白亲和色谱相比，免疫共沉淀试验的灵敏度不够高 这与抗 原浓度较低有关，但如果使抗原过量表达，又会破坏相互作用的天然 状态 免疫共沉淀是检测蛋白质间相互作用的经典方法，也是较常用的 方法。它的优点是：与蛋白亲和色谱一样，检测的产物是粗提物；抗原 与相互作用的蛋白以细胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达测试 蛋白所造成的人为效应；蛋白以翻译后被修饰的天然状态存在；复合物 以天然状态存在 Schaerer与他的同事们利用免疫共沉淀技术研究了 GABAA受体蛋白与多功能蛋白gC1q-R之间的相互作用，与酵母双杂 交试验得到的结果完全相同 其缺点是免疫沉淀蛋白有可能不是直接相互作用的蛋白，而是通 过第三者间接相互作用的蛋白，另外，其灵敏度不及蛋白亲和色谱高， 因为感兴趣的蛋白浓度不如后者高，这样驱动复合物形成的能力小 免疫共沉淀的结果初步提示PKCα和IGF1R可能发生相互作用。但这种 方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能 有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么， 以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方 法本身具有冒险性 为了解决免疫沉淀的这些 问题，本实验制备了高 效价的抗体来提高其灵敏度，此外还加大蛋白质A或G以及抗体的量， 并将最后得到的蛋白进行浓缩，以便尽可能地