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蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法 （实验报告） 实验日期：2015 年 4 月 28 日 实验温度：室温 实验地点：生物化学与遗传学实验室 指导老师：*** 班级：2013 级生物技术 1 班 姓名：** 学号：******** I. 实验目的 1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法； 2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。 II. 实验原理 考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相 合的原理设计的，这是 一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。 考马斯亮蓝 G-250 在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波 长 465nm，与蛋白质 合后变为蓝色，最大吸收波长 595nm，在一定 的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。 蛋白质与考马斯亮蓝 G-250 合，反应 2min 即可到达平衡， 复合物在室温下 1h 内保持稳定。蛋白质—考马斯亮蓝 G-250 复合物 吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质 含量。 III. 实验试剂与仪器 1.实验试剂 (1) 100μg/mL 标准蛋白质溶液 5mg 酪蛋白溶于 50mL 的 - 1 - 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 。 (2)考马斯亮蓝 G-250 试剂 50mg 考马斯亮蓝 G-250 溶于 25mL 的 95% 乙醇中，加 85%的磷酸 50mL，蒸馏水定容至 500mL。 (3)正常人血浆。 2.实验器材 可见分光光度计，100μL 微量移液器 16支，5mL 刻度吸管 8 支，中试管。 IV. 实验操作步骤 mL 0 1 2 3 4 5 样 样 品 1 品 2 标准蛋白质溶液 0 0 0 0 0 1 - - .2 .4 .6 .8 .0 血浆 0 0 0 0 0 0 0. 0. .8 .6 .4 .2 4 4 0.1mol/LNaOH - - - - - - 0. 0. 6 6 考马斯亮蓝试剂 各 5.0 1.绘制标准曲线 取中试管 8 支，按下表加入各种试剂 混匀，室温放置 5min 后即可比色。以“0”号管为空白，记录于 - 2 - 下表，绘制标准曲线。 标准曲线绘制数据表 0 1 2 3 4 5 样 样