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电化学发光免疫分析（ ECL ） --- 标记物： 三联吡啶钌 应用 ? 80 年代末期问世的新型 化学发 光 免疫分析方法。 ? 基本原理：根据三联吡啶钌 [Ru(bpy) 3 ] 和三丙胺在电场触发 下产生发光的化学发光反应。 ? 本底较小、灵敏度较高、线性 范围较宽。 缺点 ? 仪器检测速度慢 （罗氏公司） ? ECL1010 —— 60 测试 / 小时 ? ECL2010 —— 90 测试 / 小时 ? 非开放性试剂系统、不能做科 研。 ? 试剂价格过高。 31 TRFIA 在乙肝“两对半” 定量检测应用 32 ? 一、提高了检测的灵敏度 时间分辨荧光法（ TRFIA ）检测 HBsAg 灵敏度可达到 0.2ng/ml ，而酶 免法（ ELISA ）检测 HBsAg 灵敏度是 2ng/ml 。 缩短了急性乙肝检测的“窗口期” ? 二、动态观察疗效和病情检测 疾病的发生、发展、疗效、预后是个动态的变化过程， TRFIA 定量检测乙肝“两对半”各项标志物的浓度变化可对乙 肝的病程、治疗、预后起到动态检测的作用，指导医生治疗。 33 时间分辨荧光免疫技术 1 问 题 ★ 什么是时间分辨荧光免疫分析（ TrFIA ）？ ★ TrFIA 的标记物及特点。 ★ 为什么叫“时间分辨” ? ★ TrFIA 的检测原理 ★ 各种免疫方法学的比较 ★ TrFIA 的 临床应用 2 时间分辨荧光免疫 （ TrFIA ） （ Time-Resoled Fluoroimmunoassay ） 3 定 义 ? TrFIA 分析法是用 三价稀土离子及其螯合剂 作 为 示踪物 ，代替荧光物质、同位素或酶，标记 蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物 活性细胞，当反应体系发生后，用 TRF 仪器测 定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对 荧光强度比值，来判断反应体系被分析物的浓 度，达到定量分析之目的。 4 发展历程 ? 1979 年，芬兰 SOINI 和 HEMMIA 提出“时间分辨荧光免疫分析”理论 ? 1983 年 SOINI 和 KOJOLA 提出以 镧系 元素标记为示踪螯合物和 时间分辨 荧光测量相结合，建立一种新的非放射性微量 分析技术 现已经成为生物医学研究和临床超微量生 化检验中一项最有发展前景的分析手段。 5 厂 家 ? 芬兰的 WALLAC 和加拿大一家公司，但加拿大 使用激光，主要在科研 ? WALLAC 和新波公司使用疝灯，主要用于临床 6 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属 --- 镧系元素 ? 镧系元素共有 15 种，属三价元素，应用在时间分辨荧光免疫技术中 有四种： ? 铕 (Eu) 、钐 Sm) 、 镝 (Dy) 、铽 (Te) Eu3 + 的应用最为广泛， Sm3+ 可作为第二种选择以进行双标记或多标记技术 不同的三价稀土离子具有 不同发射光谱和各自不同的荧光寿命 等特点，这 样就适合进行双标记和多标记，从而实现可同时检测一个样品中，两种 或两种以上的抗原或抗体，即一个试剂盒相当与两个试剂盒或多个试剂 盒，这就是我们所说的多标记技术。 7 ? 镧系元素荧光特点： ? 荧光寿命极长 ? 镧系元素螯合物 （ 60~900 us) 铕： 714us ? 普通荧光免疫中荧光团： 1~100ns ? 样本中蛋白质荧光： 1~10ns ，易猝灭。 ? Stokes 位移大 ? 铕：发射光 613nm 、激发光 340nm ， ? 荧光素的 Stokes 位移近 280nm ? 荧光特异性强。（发射光谱带很窄： 615 ± 5nm ） 解离 - 增强技术可使其荧光性提高 100 万倍 8 时间分辨 ? 生物制品（如蛋白质）本身产生的荧光波长位于 400-600nm ，所 以用普通荧光素来检测生物样品时，自然本底的荧光干扰太大。 ? 样品中蛋白质类的本底荧光衰变时间约为 1-10ns ? TrFIA 技术中，由于镧系稀土离子螯合物所产生的荧光不仅 强度高 ， 而且 半寿期也长 ，介于 10-1000us 之间，比普通荧光标记物高 5-6 个数量级（ 1000ns=1us) 。 ? 含有铕或钐的螯合物的荧光衰变时间分别为 730000ns 和 50000 ns 。 因此利用 延缓测量时间 ，待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变 后，再检测稀土离子螯合物的荧光信号（见图 1 ）。消除了来自样 品、试剂及其他非特异荧光，从而达到降低自然本底荧光和消除 样品荧光的干扰，大大提高了检测灵敏读。这既是我们长提到的 时间分辨。 9 通过 时间 延迟，将特异性 荧光 与非特异性荧光 分辨 开来，使本底达到 0 利用镧系元素荧光物 理特性，荧光激发后 在固定时间段检测特 异性荧光。而在此时 间之前，非特异性荧 光已完全衰减为 0